Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Уильямс Б. -> "Методы практической биохимии" -> 74

Методы практической биохимии - Уильямс Б.

Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии — М.: Мир, 1978. — 273 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiprakticheskoybiohimii1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 68 69 70 71 72 73 < 74 > 75 76 77 78 79 80 .. 112 >> Следующая

При применении ЯМР для изучения биологических макромолекул приходится сталкиваться с рядом трудностей. Такие биополимеры, как белки, содержат несколько сотен и даже тысяч протонов, разонансное поглощение которых лежит в узкой области спектра. Применять ЯМР в биологии стало возможно только с появлением высокоразрешающего оборудования с привлечением вычислительной техники. Но даже в этом случае полную сверхтонкую структуру удается получить лишь для молекул, мол. вес которых не превышает 20 ООО. Так, при изучении механизма катализа рибонуклеа-зы при помощи ЯМР удалось идентифицировать протонный резонанс от четырех гистидиновых остатков молекул. Это оказалось возможным благодаря тому, что их сигналы были сильно сдвинуты относительно основной массы пиков. Более того, было показано, что два из четырех протонов находятся в каталитическом центре фермента. В действительности это уже было известно из химических данных и рентгеноструктурного анализа, однако полученные результаты являются показателем возможностей ЯМР. Основ ное преимущество ЯМР перед рентгеноструктурным анализом состоит в том, что при помощи этого метода можно следить за конформа-ционными изменениями, происходящими в пределах 100 пм. Так, многие исследователи считают, что ЯМР может оказаться незаме-
7—502
178 Часть III. Аналитические методы
нимым при изучении небольших конформационных изменений, происходящих в мембране в ходе ее функционирования, при исследовании взаимодействия ферментов с субстратами, лекарств с рецепторами и антигенов с антителами.
5.9. Масс-спектрометрия
Масс-спектрометрические методы иногда позволяют получить полное представление о структуре молекул. Применение их в биохимии особенно ценно, поскольку для эксперимента требуется всего 10“®—10~8 г вещества.
Масс-спектр — это набор пиков разной высоты, соответствующих ионам разной массы, поэтому он не похож ни на один из приведенных в этом разделе электромагнитных спектров. К сожалению, при масс-спектроскопическом анализе образец разрушается, но это не такой уж большой недостаток метода, поскольку, как мы уже отмечали,' потребляется весьма незначительное количество вещества.
5.9.1. Принцип метода
Первым шагом в масс-спектрометрическом опыте является’иони-зация вещества; при ионизации наряду с ионами исходного соединения образуются ионизованные «осколки» меньшего молекулярного веса. Как правило, все ионы заряжены положительно, а разделяются они по величине отношения массы к заряду (т/е). Метод позволяет обнаруживать соединение, даже если его доля в образце составляет -^Ю-8.
Большинство образующихся ионов однозарядны, т. е. молекулы всех соединений теряют по одному электрону, поэтому ионы различаются только по массе. Иногда, правда, молекулы теряют более одного электрона, образуются многозарядные положительные ионы. Очевидно, для двухзарядного иона отношение массы к заряду вдвое меньше, чем для такого же по массе, но однозарядного иона.
Степень фрагментации молекул при бомбардировке их электронами определяется энергией электронов (разд. 5.9.2). При низких энергиях, (1—2)-10-18 Дж, молекулы просто теряют один электрон, поэтому образовавшийся молекулярный ион имеет т]е, соответствующее молекулярному весу исходного соединения. Обычно вещества бомбардируют Электронами с энергией 10"17 Дж; в этом случае молекулы распадаются на положительно заряженные фрагменты разной массы. Способ, которым фрагментируется соединение, и, следовательно, его масс-спектр, является индивидуальной характеристикой каждого вещества (можно провести аналогию с характерными ИК- и ЯМР-спектрами — своеобразными «отпечатками
Гл. 5. Спектроскопические методы 179
пальцев»). С помощью масс-спектра можно затем установить структуру молекулы. Масс-спектры различных соединений собраны в виде каталога, который упрощает расшифровку масс-спектров неизвестных соединений. Для этого в настоящее время используются также вычислительные машины.
Масс-спектр представляет собой ряд пиков или линий, расположенных в соответствии с m/е получающихся осколочных ионов. Высота пика соответствует количеству данного вида ионов. Для калибровки горизонтальной оси по массам используется ион, mle которого соответствует m/е исходного иона.
Исходный ион на масс-спектре представлен пиком, отвечающим наибольшей массе (основной пик); однако этот ион вовсе не является преобладающим. Интенсивность линий в масс-спектре обычно выражают в процентах по отношению к интенсивности основного пика.
При ионизации двуокиси углерода образуются следующие продукты: СОг, СО+, Ог, 0+, С+; соответствующие им в масс-спектре линии имеют следующие т/е: 44, 28, 32, 16 и 12. В спектре присутствуют и минорные пики, отвечающие другим естественным изотопам тех же фрагментов: 13С+(т/е=13) и 13СОг(т/е=45).
5.9.2. Оборудование
На рис. 5.13 схематически представлено устройство масс-спектрометра с необходимой для высокого разрешения двойной фокусировкой. В приборах с одинарной фокусировкой изменяется только магнитное поле, а электростатическое остается постоянным.
Предыдущая << 1 .. 68 69 70 71 72 73 < 74 > 75 76 77 78 79 80 .. 112 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed