Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
5.6.4. Применение пламенной спектрофотометрии
Для определения натрия, калия и кальция применяются эмиссионные пламенные фотометры с фильтрами, Сигнал на всю шкалу для натрия и калия получают, используя стандартные растворы, содержащие эти элементы в количестве 1-10-в и 3-10_6 соответственно. Эмиссионные пламенные фотометры применяются для определения более двадцати элементов, встречающихся при биологических исследованиях, в основном кальция, магния, марганца, индия и таллия.
Как правило, абсорбционные пламенные спектрофотометры чувствительнее, чем атомные эмиссионные; с их помощью удается обнаружить более двадцати элементов, когда содержание их в образце составляет всего 10_в. Исключение составляют щелочные металлы. Воспроизводимость данных составляет 1%, а наилучший рабочий диапазон соответствует содержанию элементов, в 20— 200 раз превышающему их предельно обнаружимое количество (табл. 5.5).
Пламенные фотометры наиболее широко используются в клинической биохимии для определения состава крови, мочи, слюны, молока, спинномозговой жидкости и т. д. Эти данные применяются в клинической диагностике, и получаемая информация способствует успешному лечению. Такой контроль необходим при физиологических и фармакологических исследованиях биологических жидкостей. Na, К, Са, Mg, Cd и Zn определяют прямо в среде, а Си, Fe, Pb и Hg — после выделения их из биологических жидкостей.
Пламенная спектрофотометрия широко применяется при анализе почвы и растений, но соли металлов из образцов надо предварительно экстрагировать. Этим методом можно определять содержание металлов в макромолекулах, органеллах, клетках и тканях, при этом в каждом случае необходимо правильно выбрать способ первоначального сжигания вещества.
Гл. 5. Спектроскопические методы 171
5.6.5. Флуоресцентная атомная спектрофотометрия
В этом случае свет испускается атомами, перешедшими в возбужденное состояние не вследствие нагревания образца, а в результате поглощения света. Само явление аналогично молекулярной флуоресценции, отличие лишь в том, что флуоресцируют атомы в газе, а не молекулы в растворе. Для хорошего анализа необходим достаточно интенсивный источник света, но в отличие от абсорбционной атомной спектрофотометрии, благодаря резонансному поглощению атомов, нет необходимости в хорошем монохроматоре. Модуляция усилителя детектора, той же частотой, что и у первичного источника напряжения, исключает регистрацию прямого света от пламени. .
Флуоресцентные атомные спектрофотометры имеют очень высокую чувствительность; например, с их помощью можно обнаруживать цинк и кадмий, когда их содержание в образце составляет всего ЫО-10 и 2-10~10 частей соответственно.
5.7. Электронный парамагнитный, резонанс
Этот метод применяется для исследования соединений, обладающих парамагнитными свойствами, т. е. соединений, магнитный момент которых обусловлен неспаренными электронами. Магнитным моментом могут обладать ионы переходных металлов и их комплексы, свободные радикалы и соединения в возбужденном состоянии.
5.7.1. Принцип метода1
Электроны обладают зарядом и механическим моментом вращения (спином) и тем самым ведут себя подобно магнитам, а точнее, обладают магнитным моментом. Во внешнем магнитном поле магнитные моменты электронов могут быть ориентированы по направлению магнитного поля или антипараллельно ему. Первая ориентация отвечает более низкому энергетическому состоянию, чем вторая. Переход электрона в более высокое энергетическое состояние с антипараллельным спином происходит при поглощении определенного кванта энергии, и для неспаренного электрона такой резонансный переход требует энергию
где h — постоянная Планка, v — частота электромагнитного поля,
1 Явление электронного парамагнитного резонанса было обнаружено в 1944 г. советским ученым физиком Е. К- Завойским. — Прим. перев.
172 Часть III. Аналитические методы
g — константа, фактор спектроскопического расщепления, (3 — магнитный момент электрона, называемый магнетоном Бора, Н ¦— напряженность внешнего магнитного поля.
В магнитном поле с напряженностью IT (104 Гс) поглощаемая электромагнитная энергия лежит в микроволновом диапазоне. Такое явление поглощения энергии называется электронным парамагнитным резонансом (ЭПР).
Из приведенной выше формулы видно, что частота поглощаемого микроволнового излучения зависит от парамагнетизма образца (Р) и напряженности внешнего магнитного поля (Я). Обычно частоту поля поддерживают постоянной и снимают зависимость поглощения от напряженности магнитного поля. Поглощение регистрируется в виде пика ЭПР, спектр которого соответствует парамагнетизму образца. Площадь пика зависит от концентрации неспаренных электронов в образце; ее можно определить, если предварительно снять спектр образца, содержащего неспаренные электроны известной концентрации.
Для делокализованного электрона g = 2,0023; для связанных электронов, особенно в переходных металлах, g разное, и точное измерение g-фактора дает информацию о характере связывания электрона в молекуле.
