Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Спин-решеточное взаимодействие, т. е. взаимодействие неспаренного электрона с остальной частью молекулы, уширяет пики поглощения на спектрах ЭПР. Величина такого уширения также дает информацию о структуре молекул.
Сверхтонкое расщепление пиков ЭПР, возникающее из-за взаимодействия неспаренных электронов с магнитным полем ядер, дает еще одну возможность для выяснения расположения атомов в молекуле. Сверхтонкое расщепление в свободных радикалах на протонах *Н наблюдается в поле 3-10_3 Т и дает информацию, аналогичную той, которую получают при помощи ядерного магнитного резонанса с высоким разрешением (ЯМР, см. разд. 5.8). Поэтому методы 'ЯМР и ЭПР взаимно дополняют друг друга.
5.7.2. Оборудование
Схематически устройство спектрометра ЭПР приведено на рис. 5.10. В этих приборах применяют постоянные электромагниты, дающие поле 50 — 500 мТ с точностью 10"®. Как правило, используют электромагнит, дающий постоянное поле 330 мТ, и варьируют его в пределах 10—100 мТ при помощи дополнительного свип-маг-нита. Клистроновый осциллятор генерирует электромагнитное излучение в сантиметровом диапазоне, обычная длина волны составляет 3-10-2 м (частота 9000 МГц). Образец должен находиться в твердом состоянии, поэтому биологические объекты замораживак^г в жидком азоте.
Гл. 5. Спектроскопические методы 173
Для удобства анализа спектр представляют в виде зависимости первой производной поглощения dAIdH (а не самого поглощения) от напряженности поля. Поэтому он представляет собой не набор
Рис. 5.10. Схема устройства спектрометра электронного парамагнитного
резонанса.
1 — клвстрон; 2 — металлический волновод; 8 — полость для образца; 4 — основное магнит; S —1 дополнительный свип-магнит; S — кристаллический детектор; 7 — усилитель; 8 — само*
писец; 9 — осциллятор.
Рис. 5.11. Спектры ЭПР; зависимость поглощения А от напряженности .поля Н (а) и зависимость первой производной поглощения (dAIdH) от магнитного
поля Н (б).
симметричных пиков (рис. 5.11,а),- а имеет вид, приведенный на рис. 5.11,6.
5.7.3. Применение
Электронный парамагнитный резонанс — один из основных методов, применяемых при изучении металлоферментов, особенно тех, которые содержат молибден (ксантиноксидаза), медь (цито-хромоксидаза, медно-голубые ферменты) и железо (цитохромы, ферредоксин). Оба элемента, медь и не входящее в состав гема железо, не поглощают видимый и ультрафиолетовый свет, а в одном из своих окисленных состояний дают пики на спектрах ЭПР. Появление или исчезновение их сигналов ЭПР позволяет изучать
174 Часть III. Аналитические методы
роль этих элементов в работе многоферментных систем интактных митохондрий и хлоропластов, а также изолированных ферментов.
В металлоферментах атомы металлов имеют определенное число лигандов, расположенных по отношению к ним специфическим образом. Такими лигандами обычно являются аминокислотные остатки белков. Применение ЭПР убедительно показало, что пространственное расположение лигандов в металлоферментах часто отличается от того, которое получается в модельных системах. Возможно, такие отличия связаны с определенной биологической функцией металлоферментов.
Применение метода ЭПР расширилось с использованием спиновой метки — методики, состоящей в том, что стабильный нереакционноспособный свободный радикал присоединяют к биологической макромолекуле, которая не имеет неспаренных электронов. Так, пометив стабильным радикалом нитроксидом глицерофосфа-тиды, удалось исследовать их диффузию в мембранах, а также их «перескакивание» между наружной и внутренней поверхностями 'бислоя липидов.
Электронный парамагнитный резонанс широко применяется для исследования свободных радикалов, возникающих под действием облучения. Наконец, в настоящее время появился новый метод, являющийся мощным орудием для изучения структур молекул, — ДЭЯР (двойной электронно-ядерный резонанс), объединяющий ЭПР и ЯМР.
5.8. Ядерный магнитный резонанс
Этим методом регистрируют атомы, ядра которых обладают магнитным моментом. Эго, как правило, атомы, имеющие нечетный заряд ядер, т. е. содержащие в ядре нечетное число протонов.
5.8.1. Принцип метода
Поскольку протоны обладают спином и зарядом, они, как и электроны, имеют магнитный момент, но у ядер он примерно в 2000-раз меньше, чем у электронов. В магнитном поле ядро со спином 1/2 может находиться в двух состояниях; в одном из них магнитный момент направлен параллельно полю, а в другом — антипараллельно. Антипар аллельное расположение магнитного момента отвечает более высокоэнергетическому состоянию ядра. Переориентация магнитного момента ядра от параллельного к антипараллель-ному сопровождается резонансным поглощением электромагнитной. энергии. В магнитном поле напряженностью несколько сотен миллитесел (несколько тысяч гаусс) резонансное поглощение ядер происходит в радиодиапазоне электромагнитных колебаний; это
Гл. 5. Спектроскопические методы 175
явление называется ядерным магнитным, резонансом (ЯМР). Большинство исследований проводится с самым легким изотопом — протоном *Н; в этом случае принято говорить о протонном магнитном резонансе (ПМР). В биохимических исследованиях используется также резонансное поглощение ядер 13С, 16N, 1BF и 31Р, спин которых равен 1/2. Ядра других элементов, часто встречающихся в биологических объектах, такие, как 12С, 1вО и 32S, имеют нулевой спин, поэтому не имеют магнитного момента, а следовательно, не дают сигналов ЯМР.
