Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Разделение веществ с помощью ионообменной хроматографии обычно проводят на колонках, заполненных специальной ионообменной смолой. Существует два типа ионообменных смол — катио-нообменники и анионообменники. Катионообменные смолы содержат отрицательно заряженные группы, которые притягивают положительно заряженные молекулы. Эти смолы называют также кислотными ионообменниками, так как отрицательные заряды возникают на них в результате протолиза кислотных групп. Анионообменные смолы содержат положительно заряженные группы, притягивающие отрицательно заряженные молекулы. Их называют иногда основными ионообменниками, так как положительные заряды возникают, как правило, в результате связывания протонов с фиксированными основными группами.
Многие ионообменные смолы, применяющиеся для разделения биологических соединений, получают путем сополимеризации стирола и дивинилбензола (рис. 3.10).
Полистирол — это линейный полимер, растворимый в некоторых растворителях. При реакции конденсации стирола с дивинилбензо-лом между молекулами образуются поперечные связи (сшивки), в результате чего получается нерастворимая смола. Изменяя соотношение стирола и дивинилбензола, можно регулировать степень сшивания. Чем выше содержание дивинилбензола в сополимере по сравнению со стиролом, тем больше число поперечных связей.
При обработке поперечно-связанного полистирола концентрированной серной кислотой (сульфирование) получают сульфированную полистирольную смолу, например дауэкс 50 — сильнокислый ионообменник. SOgH-группы ионизуются при всех значениях pH, за исключением очень низких. Сильноосновные ионообменни-ки получают в ходе реакции между поперечно-связанным полистиролом и хлорметиловым эфиром с последующей реакцией хлорзаме-щенных групп с третичными аминами. CH2N+(CH3)3C1 "-группы ио-
88 Часть II. Методы разделения
низуются при всех значениях pH, за исключением очень щелочных.
Катионообменные и анионообменные смолы можно разделить в зависимости от силы их кислых и основных групп. В качестве полярных групп в катионообменных смолах выступают либо —S03H-группы (сильнокислые), либо —С02Н-группы (слабокислые). Полярными группами в анионообменниках являются третичные или чет-
Рис. 3.10. Сополимеризация стирола и дивинилбензола.
вертичные аммонийные группы —CH2NR2 (слабоосновные) или —CH2N+R3 (сильноосновные). В табл. 3.6 приведены некоторые имеющиеся в продаже смолы. Ряд смол со стирольной основой разрушает белки, поэтому для анализа белков лучше применять смолы
с макромолекулярной акриловой решеткой.
Таблица 3.6
Типы ионообменных смол
Тип смолы Название смолы
Слабокислая Цеокарб 226, амберлит IRC 50, биорекс 70
Сильнокислая Дауэкс 50, цеокарб 225, амберлит IR 120, био
Слабоосновная рад AG 50
Сильноосновная Амберлит IR 45, деациДит Н, деацидит G, био
рад AG 3
Дауэкс 1, дауэкс 2, биорад AG 1 и. AG2
В буферном растворе ионообменная смола набухает, а частицы ее образуют решетчатую структуру. Смолы с большим количеством поперечных сшивок образуют матрицу, внутрь которой могут проникать лишь очень мелкие молекулы, а крупные не достигают ионообменного участка. Смолы с небольшим числом поперечных связей имеют «ячейки» большего размера, позволяющие крупным молекулам проникать внутрь гранул смолы к заряженным группам
Гл. 3. Хроматографические методы 89
на ионообменном участке. Ионный обмен, как правило, происходит очень быстро,-поэтому скорость всего процесса в целом лимитируется скоростью диффузии ионов через смолу. Таким образом, чем меньше число поперечных связей, тем быстрее ионы проникают внутрь гранул смолы и достигают ионообменного участка. Процесс ионного обмена предположительно состоит из пяти этапов.
1) Диффузия иона к поверхности смолы. В гомогенных растворах этот процесс происходит очень быстро.
2) Диффузия иона внутрь гранул смолы к ионообменному участку. Скорость диффузии зависит от степени сшитости смолы и концентрации раствора. Эта стадия является лимитирующей для всего процесса ионного обмена.
3) Обмен ионов на ионообменном участке. Этот процесс происходит мгновенно и является равновесным.
Катионообменная смола:
К R
\ \ ¦
SCT ... Na++ NH3 — R' ^ SO~ ... NH3 — R' + Na+ Анионообменная смола:
R R
XN ... СГ+ -OOC —R' ...-OOC — R'+ Cl-
\ \
(CH3)3 (CHJs
Чем выше заряд обменивающейся молекулы, тем прочнее она связывается со смолой и тем труднее обменивается на другие ионы.
4) Диффузия обмениваемого иона через смолу к поверхности ионообменника.
5) Десорбция элюентом и диффузия обменявшегося иона в окружающий раствор.
Как мы уже говорили, в буферном растворе смола поглощает воду и набухает. Набухание смолы обязательно должно закончиться до заполнения ею колонки; в противном случае этот процесс будет продолжаться в колонке, что нарушит процесс разделения. Смолу оставляют набухать в стакане с дистиллированной водой; ненабухшие мелкие частицы смолы, называемые «пылью», удаляют. Всю эту процедуру повторяют несколько раз, чтобы полностью удалить «пыль», затрудняющую протекание растворителя через колонку. Затем смоле дают отстояться вплоть до полного ее набухания. Время, необходимое для полного набухания смолы, зависит от степени ее сшитости.
