Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Гл. 3. Хроматографические методы 85
менем удерживания. От опыта к опыту условия эксперимента несколько меняются, поэтому вместе с исследуемым образцом обычно хроматографируют стандартное соединение (так называемый внутренний стандарт); иногда такое соединение пропускают через колонку отдельно. Время выхода исследуемого соединения из колонки по отношению к таковому для стандарта называется относительным временем удерживания (/д) и является постоянным для данной колонки в различных экспериментальных условиях. Поэтому при проведении качественного анализа неизвестные компоненты можно идентифицировать, сравнивая величины их tR с таковым для уже известных соединений.
3.5.7. Внесение образца
Обычно образец растворяют в нужном растворителе и вносят раствор с помощью шприца (обычно от 0,1 до 10 мм3) в верхнюю часть колонки через специальную перегородку (диафрагму). Как правило, место внесения образца в колонку (дозатор) имеет более высокую температуру, чем сама колонка, особенно в тех случаях, когда вносят большие объемы образца или если образец имеет высокую скрытую теплоту испарения; температура поддерживается с помощью нагревательного элемента. Твердые образцы наносят на колонку посредством специальных шприцов или особых автоматических устройств.
Наряду с изотермическим методом, когда температура колонки во время всего процесса разделения поддерживается постоянной, применяется и другая методика, при которой температура колонки постепенно повышается и регулируется особым программирующим устройством. Однако при этом часто наблюдается избыточная Потеря неподвижной фазы, что приводит к неконтролируемым изменениям базовой линии на самописце. В связи с этим многие системы снабжены двумя одинаковыми колонками с детекторами, одна из которых является контрольной. Проходящие через детектор токи сравнивают; при одинаковой температуре потеря вещества с обеих колонок одинакова, а при повышении температуры в одной из них избыточная потеря вещества обусловливает не равный нулю результирующий ток, который регистрируется самописцем как постоянная базовая линия.
3.5.8. Количественный анализ
Количество вещества определяют по площади (а иногда высоте) пика на диаграммной ленте самописца. Площадь пика измеряют либо планиметрическим способом, либо умножением высоты пика на ширину, которую он имеет на половине высоты. Пики можно также вырезать и взвешивать. Некоторые усовершенствованные сис-
86 Часть II. Методы разделения
темы для ГЖХ снабжены интеграторами, которые измеряют относительное время удерживания и определяют площади пиков. Для установления зависимости между площадью пика и количеством вещества проводят предварительную калибровку прибора с помощью стандартных соединений, концентрация которых хорошо известна.
При количественном анализе обычно используют внутренний стандарт — соединение, которое по физическим свойствам очень близко к исследуемому и при хроматографировании движется вдоль колонки в непосредственной близости от исследуемого соединения, но все-таки не вместе с ним. Определенное количество стандарта добавляется к исследуемому веществу на самых ранних стадиях разделения и поэтому проходит с ним все последующие стадии. Выход внутреннего стандарта определяют по заранее составленной калибровочной кривой. Поскольку любые потери стандартного соединения в ходе анализа будут равны потерям исследуемого вещества, можно рассчитать концентрацию последнего в исходном образце.
В тех случаях, когда стандартных соединений для исследуемых веществ подобрать не удается, проводят исследования путем сочетания газожидкостной хроматографии, с масс-спектрометрией (разд. 5.9).
3.5.9. Получение химических производных проб
Некоторые соединения ввиду особой природы входящих в их состав химических групп нельзя разделять методом ГЖХ. Эти соединения удерживаются на колонке слишком долго, и для ускорения разделения стараются получить такие их химические производные, у которых значительно выше летучесть, а следовательно, и эффективный коэффициент распределения!. Жирные кислоты обычно превращают в метиловые эфиры, углеводы подвергают силанизации, а аминокислоты силанизируют по карбоксильным группам или ацети-лируют по аминогруппам..
3.5.10. Препаративная ГЖХ
С помощью соответствующих колонок и коллекторов фракций удается получать большие количества разделяемых компонентов за счет повторной хроматографии образца. Для этого в нижней части колонки имеется система отвода, посредством которой небольшая часть газа направляется в детектор для регистрации, а остальная поступает в коллектор, где разделенные компоненты захватываются в ловушку с жидким азотом. Этот метод является особенно ценным, поскольку многие соединения удается разделить пока только с помощью ГЖХ.
Гл. 3. Хроматографические методы 87
Аналогичным образом при помощи ГЖХ разделяют любые радиоактивные соединения; после разделения фракции собирают и определяют их радиоактивность.
3.6. Ионообменная хроматография
3.6.1. Принцип метода
Данный вид хроматографии основан на притяжении между противоположно заряженными частицами. В основе разделения многих биологических соединений, таких, как аминокислоты и белки, лежит тот факт, что эти соединения содержат способные к ионизации группы, которые обусловливают суммарный положительный или отрицательный заряд соединения; величина заряда зависит от pH и изоионной точки (разд. 1.2.3).
