Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Набухшую смолу помещают в колонку (разд. 3.10.2) и подвергают регенерации, пропуская через колонку 1 н. раствор НС1 (в случае катионообменника) или NaOH (в случае анионообменни-ка). Затем колонку промывают дистиллированной водой до пол-
90 Часть II. Методы разделения
ного удаления регенерирующего вещества, после чего колонка готова к употреблению. Отработанную смолу можно использовать повторно, для чего ее необходимо предварительно регенерировать, промыв раствором NaOH или НС1.
3.6.2. Ионообменная хроматография на колонке
Происходящий в колонке процесс можно проиллюстрировать на примере катионообменника, имеющего такую величину pH, при которой смола полностью ионизирована и насыщена катионами (А+). Это происходит при пропускании через колонку буферного раствора, содержащего катионы А+. Если пропустить через колонку раствор с другими катионами (Б+), сохраняя pH таким, чтобы смола оставалась полностью ионизированной, часть катионов А+ будет замещаться катионами Б+ вплоть до достижения равновесия.
Смола—0~ ... А+ + Б* =е* Смола—0“ ... Б+ -f- А+.
Установившееся равновесие зависит от таких факторов, как концентрация комплекса Смола—0~...А+, концентрация катионов Б+ и относительное сродство ионообменного материала к катионам А+ и Б+. По мере прохождения через колонку раствора, содержащего катионы Б+, непрерывно происходит процесс уравновешивания, в результате чего катионы Б+ могут почти полностью связаться со смолой. При соответствующих условиях (pH, температура, ионная сила раствора, скорость протекания буферного раствора через колонку и т. д.) можно достичь того, что катионы Б+ свяжутся со смолой в определенном, небольшом участке колонки.
Чтобы элюировать катионы Б+ с колонки, через нее пропускают другой буферный раствор. Этот раствор может иметь более низкую величину pH, тогда вытеснение катионов Б+ будет происходить за счет повышения эффективной концентрации ионов водорода, или такую же величину pH, но большую ионную силу. Другой способ состоит в использовании буферного раствора с такими же pH и ионной силой, но содержащего катионы с большим сродством к ио-нообменнику, чем катионы Б+.
У аминокислот, суммарный заряд которых зависит от pH, при низких значениях pH заряд каждой молекулы будет положительным, т. е. молекулы будут связываться с сильнокислой катионообменной смолой. По мере возрастания pH пропускаемого через колонку буферного раствора аминокислота постепенно теряет свой положительный заряд, и степень связывания ее со смолой ослабевает, что в конечном итоге приводит к элюированию молекул аминокислоты. Ввиду того что различные аминокислоты содержат группы с разной степенью кислотности (разд. 1.2.3), они элюируют с колонки последовательно: сначала при pH 3—4 кислые аминокислоты (аспарагиновая и глутаминовая), затем нейтральные (глицин
Гл. 3. Хроматографические методы ¦ 91
и аланин). Основные аминокислоты (аргинин и лизин) сохраняют свой положительный заряд и при более высоких значениях pH и элюируют с колонки последними — при pH 10—11.
Вышеперечисленные принципы лежат в основе выпускаемых промышленностью приборов для автоматического аминокислотного анализа,- работающих по принципу, предложенному Муром и Стай--ном. Схема такого аминокислотного анализатора изображена на рис. 3.11.
Образец, например белковый гидролизат, поступает в анализатор через особую систему ввода и с помощью насоса подается на
Рис. 3.11. Схема аминокислотного анализатора.
I — градиентная камера; 2 — система подачи образца; 3 — яасос; 4 — ионообменная колонка; 5 — азот; 6 —краситель; 7 — нагреватель; 8 — охлаждающий амеевнк; 9 — колориметр (440 им); 10— колориметр (570 нм); 11 — самописец.
колонку, заполненную сильнокислым катионообменником при низком pH. Затем через колонку пропускают буферный раствор, pH и ионную силу которого постепенно повышают, смешивая в особой градиентной камере растворы с различающимися pH и ионной силой. К выходящему из колонки элюату добавляют краситель, например нингидрин, и насыщают азотом; газ стараются пропускать осторожно, чтобы не происходило слишком интенсивного перемешивания элюируемых веществ. Затем смесь нагревают на масляной бане до получения интенсивного окрашивания, охлаждают, пропуская через змеевик, и колориметрируют при 570 нм для измерения интенсивности синей окраски, обусловленной реакцией аминокислоты с нин-гидрином,. Колориметр связан с двухканальным самописцем, который постоянно регистрирует выход элюата из колонки. Аминокислоты пролин и оксипролин окрашиваются нингидриномв желтый цвет, поэтому для регистрации этих двух аминокислот элюат пропускают через второй колориметр, настроенный на 440 нм, который также соединен с самописцем. Многие аминокислотные анализаторы имеют две колонки (вторую колонку заполняют основной анионообменной
92 Часть II. Методы разделения
смолой и используют для отделения основных аминокислот от аммиака).
Для разделения методом ионообменной хроматографии высокомолекулярных соединений (например, белков и нуклеопротеидов) широко пользуются модифицированной целлюлозой. Обычные смолы с большим количеством поперечных связей для этой цели не подходят, поскольку они непроницаемы для крупных молекул. Целлюлоза же, напротив, является хорошим ионообменником, во-первых, потому, что имеет волокнистую структуру, а, во-вторых, большинство функциональных групп у нее расположено на поверхности волокон, в результате чего они легко доступны для макромолекул. Особенно хорошим катионообменником является карбоксиметил-целлюлоза (КМ-целлюлоза), в которой СН2ОН-группа замещена на СН2ОСН2СОО-группу; одним из наиболее эффективных анионооб-менников является диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза). В последнее время широко применяется ГЖХ. на ионообменных материалах.
