Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
3.4.3. Применение метода
Метод широко применяется для разделения различных видов нуклеиновых кислот, в частности для очистки некоторых видов РНК и стероидных гормонов. Применение метода для разделения
80 Часть II. Методы разделения
В
Рис. 3.7. Прибор для противоточного распределения.
аминокислот и пептидов обычно ограничивается препаративными целями* поскольку для аналитических целей существуют лучшие методы. Метод используется также для, препаративного выделения антител пептидной и непептидной природы.
Для разделения клеток и клеточных частиц используется модифицированный метод противоточного распределения, основанный на распределении частиц между жидкой фазой и поверхностью раздела двух фаз. В этом случае клетки и клеточные частицы распределяются не между двумя жидкими фазами, как это имеет место при обычном противоточном распределении, а между одной фазой и границей раздела двух фаз. Эти фазы обычно представляют собой смесь растворимых в воде полимеров, таких, как декстроза или полиэти-ленгликоль. Метод применяется для разделения различных штаммов бактерий, водорослей и вирусов, для отделения интактных клеточных органелл от разрушенных и для выделения различных частиц из комплексов антиген—антитело.
Для ускорения процесса разделения был создан специальный прибор для противоточного распределения в тонком слое обеих фаз, в котором время отстаивания значительно сокращено.
Гл. 3. Хроматографические методы 81
3.5. Газожидкостная хроматография
3.5.1. Принцип метода
Метод основан на распределении соединений между жидкой и газовой фазами и благодаря высокой чувствительности и быстроте разделения используется для количественного и качественного анализа широкого круга соединений. Неподвижную фазу из «жидкого»
— z
f
5
Рис. 3.8. Схема устройств прибора для газожидкостной хроматографии (а) и пламен но-ионизационного детектора (б).
/ — детектор; 2 — усилитель; 3 — самописец; 4 — интегратор; 5 — газ-носитель; 6 — место введения пробы; 7 — устройство, регулирующее температуру термостата; 8 — хроматографическая колонка; 9—термостат; 10— воздух; //— водород; 12— запальное устройство;
13 — выходное отверстие; 14 — плами; /5 — электрод.
материала (например, силиконовой смазки) закрепляют на инертном гранулированном твердом носителе и помещают в узкую стеклянную или стальную колонку, через которую пропускают инертный газ (подвижная фаза), например аргон или азот. Колонку помещают в термостат с температурой, при которой исследуемое вещество испаряется. В основе разделения анализируемых соединений по мере их продвижения по колонке с газом-носителем лежит различие в коэффициентах распределения испарившихся анализируемых веществ между жидкой и газовой фазами. После выхода из колонки вещества попадают в детектор, связанный через усилитель с самописцем (рис. 3.8).
3.5.2. Твердый носитель
Твердый носитель представляет собой поверхность, на которую наносят и закрепляют слой неподвижной фазы; необходимо, чтобы носитель был химически инертным по отношению к анализируемому образцу. Важно также, чтобы концентрация нанесенного слоя неподвижной фазы была достаточно высока; в противном случае об-4—502
82 Часть П. Методы разделения
разец будет взаимодействовать с носителем, что ухудшит разделение. Из твердых носителей обычно применяют целит (диатомовую землю) с модифицированными гидроксильными группами. Силани-зация целита (введение атомов кремния) с помощью таких соединений, как гекеаметилдисилазан, уменьшает взаимодействие твердого носителя с образцом. Кроме носителя, силанизации подвергают стеклянную колонку, тампон из стеклянной ваты, а также все остальные поверхности, . непосредственно контактирующие с образцом.
3.5.3. Неподвижная фаза
Неподвижная фаза должна быть нелетучей и устойчивой к температуре, при которой производится анализ. В качестве неподвижной фазы часто используют органические соединения с высокой тем-
Рис. 3.9. Параметры, характеризующие газожидкостную хроматограмму.
х — ширина пика у основания; у — расстояние от места введения образца до максимума 1 пика.
пературой кипения, которые наслаивают на носитель в концентрации от 1 до 25%, в зависимости от условий анализа. Неподвижные фазы бывают двух типов — избирательные, когда разделение основано на различиях в химических свойствах разделяемых компонентов, и неизбирательные, когда в его основе лежит различие в температуре кипения компонентов. Выбор температуры, при которой проводят анализ, зависит от природы неподвижной фазы. Слишком высокая температура вызывает испарение фазы, загрязнение детектора и искажение базовой линии. Выбор фазы зависит от природы исследуемого соединения и чаще всего основывается на литературных данных. Одну и ту же колонку можно многократно использовать в течение нескольких месяцев. В табл. 3.5 приводится перечень некоторых фаз для газожидкостной хроматографии и их применение.
Гл. 3. Хроматографические методы 83
Таблица 3.5
Некоторые неподвижные фазы для газожидкостной хроматографии
