Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Как мы уже говорили, после проведения ТСХ разделенные соединения удаляют с пластинок, соскабливая их вместе с адсорбентом и элюируя с помощью соответствующих растворителей.
Покрывая пластинки более толстым слоем адсорбента (до 5 мм), можно одновременно хроматографировать гораздо большее количество материала (препаративная ТСХ). В этом случае пробу наносят не в виде пятна, а в виде полосы вдоль одной из сторон пластинки; после хроматографирования соединения располагаются на пластинке в виде отдельных полос.
Далеко не всегда можно идентифицировать соединения по значению величины Rf (определение см. в разд. 3.3.1), так как эта величина не является постоянной. Поэтому по возможности пробу
Гл. 3. Хроматографические методы 73
следует хроматографировать вместе с известными соединениями (стандартами).
Часто разделить сложные смеси веществ при помощи обычных адсорбентов не удается. Для разделения некоторых смесей с успехом применяют метод аргенпгации в тонком слое (серебрение). В этом случае при подготовке пластинок к суспензии адсорбента добавляют азотнокислое серебро; по мере высыхания пластинок адсорбент пропитывается AgN03. Этот метод особенно хорош для разделения веществ, отличающихся друг от друга количеством и расположением связей, поэтому он применяется в основном для разделения липидов.
В данном разделе ТСХ рассматривается как метод разделения, основанный на сорбции веществ, однако имеются адсорбенты (например, целлюлозный порошок), которые одновременно обладают как адсорбционными свойствами, так и распределяющей способностью. Путем специальной обработки адсорбента можно почти полностыо превратить процесс в распределительное разделение (разд. 3.3.1). При подготовке пластинок адсорбенты для повышения эффективности разделения часто насыщают различными буферами. В табл. 3.3. приведены некоторые системы растворителей, применяющихся для разделения определенных групп соединений.
Одно из главных преимуществ метода ТСХ — быстрота разделения. Применение в качестве подвижной фазы летучих веществ позволяет сократить время разделения до 30 мин, однако даже
Таблица 3.3
Некоторое системы растворителей, применяющиеся в тонкослойной хроматографии
Соединения
Адсорбент
Система растворителей, объем/объем
Аминокислоты
Силикагель G
96%-ный этанол/вода (70/30)
Этилацетат/1 -пропанол (65/35)
н-Бутанол/уксусная кнс-лота/вода (80/20/20)
Моно- и дисахариды Кизельгур G (ацетат натрия)
Кизельгур G (фосфат натрия, pH 5)
н-Бутанол/ ацетон/фосфатный буфер, pH 5 (40/50/10)
Нейтральные липиды .Силикагель G
Петролейный эфир/ди-этиловый эфир/ ацетон (90/10/1)
Холестериновые эфиры Силикагель G
Тетрахлорэтан/хлоро- ¦ форм (95/5)
Каротиноиды
Фосфолипиды
Кизельгур G Силикагель G
Петролейный эфир/ 1-пропанол (99/1)
Хлороформ/метанол/вода (65/25/4)
74 Часть II. Методы разделения-
при применении нелетучих растворителей продолжительность разделения редко превышает 90 мин.
Существуют некоторые виды хроматографической бумаги, заранее пропитанной адсорбентом. Они применяются в бумажной хроматографии (разд. 3.3.1), но действие их основано на сорбции.
3.3. Распределительная хроматография
3.3.1. Хроматография на бумаге
Этот метод основан на распределении соединения между двумя жидкими фазами. Хроматографическая бумага обладает свойством поглощать воду из атмосферы и задерживать ее между своими целлюлозными волокнами. Эту воду можно рассматривать как один из растворителей; она представляет собой неподвижную фазу. Когда по б(умаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вместе с растворителем, н наоборот.
Зачастую подвижная фаза представляет собой смешивающийся с водой растворитель (например, ацетон и бутанол); казалось бы, в таких случаях разделения не должно происходить, поскольку имеется только одна фаза (обычно для разделения требуется два несмешивающихся растворителя). Однако если вдуматься, что такое хроматографическая бумага, станет ясно, что более правильно рассматривать ее как комплекс целлюлоза—вода. По мнению ряда авторов, этот комплекс напоминает концентрированные водные растворы полисахаридов. Такие растворы никогда не смешиваются с большинством органических растворителей, в том числе и с теми, которые смешиваются с водой.
Расстояние, пройденное нанесенным на бумагу соединением в направлении движения растворителя, характеризуется величиной Rf и определяется следующим отношением:
Расстояние, пройденное растворенным соединением Расстояние, пройденное фронтом растворителя
В стандартных экспериментальных условиях эта величина является для данного соединения постоянной и соответствует его коэффициенту распределения. Для углеводов вместо величины Rf для удобства пользуются величиной Ra , которая выражается так: Расстояние, пройденное углеводом
