Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
В этой главе описаны основные приемы, используемые при очистке ферментов. В гл. 3, 4 и 5 подробно рассматриваются методы фракционирования, применяемые для выделения ферментов. Но прежде чем приступить к дальнейшей работе, необходимо приготовить экстракт исходного материала; получение этого экстракта описывается в следующей главе.
3—1078
ГЛАВА 2
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭКСТРАКТА
2.1. ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ
Для многих исследователей, занимающихся очисткой ферментов, большая часть этого раздела будет малоинтересна, так как им не приходится выбирать исходный материал. Причины этого могут быть самые различные — например, лаборатория может работать только с каким-то одним органом или видом и единственной заботой в этом случае будет обеспечение достаточного количества сырья в нужное время и сохранение его в замороженном виде перед использованием.
В некоторых случаях исследователь имеет возможность выбирать ткань, из которой он будет выделять фермент, либо он может работать с определенной тканью или органом, выбирая по своему усмотрению вид организма. При выборе организмов того или иного вида, используемых для выделения ферментов, руководствуются преимущественно легкостью их выращивания. Из животных наиболее широко используются крыса (особенно при работе с печенью) и кролик (при работе со скелетными мышцами).
Если работа проводится с органами, размеры которых слишком малы у лабораторных животных (сердце, мозг, почки, тимус), то используется мясной скот, в основном быки и свиньи. Кроме того, не следует забывать, что человек — это тоже животное, и именно ради него приносят в жертву такое множество лабораторных животных; при этом исходят из предположения, что то, что справедливо для крысы, вероятно, справедливо и для человека. Изучение ферментов тканей человека ограниченно по понятным причинам. С другой стороны, человеческая кровь вполне доступна, и существует множество методов выделения ферментов из эритроцитов и других клеток крови. Плазма крови бедна ферментами, но содержит значительные количества неферментных белков. В последнее время изучение ферментов из различных видов стало более обычным. Частично это обусловлено уяснением того, что многие важные особенности метаболического контроля, локализации ферментов и другие их характеристики значительно различаются даже в пределах типа позвоночных.
Приготовление экстракта
35
Ферментам беспозвоночных уделяют довольно мало внимания в основном из-за того, что в большинстве своем беспозвоночные животные очень малы и для получения необходимого количества исходного материала приходится использовать много особей. Если нужный орган не извлекают из каждой особи (трудная задача при работе с насекомыми), то очистка гомо-гената, приготовленного из целого тела, осложняется тем, что в нем содержится большое количество пищеварительного сока с протеолитическими ферментами, которые также высвобождаются в экстракт. Большая часть хорошо известных ферментов беспозвоночных получена из крупных ракообразных, таких, как речной рак и краб.
Долгое время биохимия растений была очень слабо связана с биохимией животных, главным образом из-за того, что последняя имеет медицинскую направленность, а также потому, что при работе с растениями перед энзимологом встают определенные трудности. Качественные различия, связанные с сезонностью, могут быть преодолены, если выращивать растения в специальных камерах; в противном случае приходится мириться с вариабельностью материала, выращенного под открытым не--бом. В силу очевидных причин из огромного множества видов для изучения используются в основном те, которые имеют экономическое значение, но, с точки зрения биохимика, это не всегда наилучший выбор. Тем не менее работают преимущественно на одном или двух видах растений вследствие того, что из их листьев можно без особого труда приготовить экстракты, а из них легко выделить хлоропласты. Наиболее часто используются шпинат Spinacia oleracea и в какой-то мере родственная ему свекла Beta vulgaris, которые хорошо растут в различных климатических условиях. Растительные клетки имеют множество компартментов (отсеков); в большинстве случаев основной объем клетки занимает вакуоль, заполненная весьма кислыми растворами, протеазами и целым рядом других, вредных для цитоплазмы веществ. Значительная часть цитоплазмы приходится на хлоропласты, гранулы крахмала и другие органеллы; в клетке имеется также объемистая клеточная стенка (целлюлоза). Цитоплазма (которая вместе с хлоропластами содержит большую часть ферментов) часто может составлять не более
il—2% всего объема растительной клетки. Следовательно, растительные экстракты содержат очень мало белка, даже если при их приготовлении добавляют минимальное количество жидкости.
При работе с микроорганизмами возникают другие проблемы. Животный материал можно получать на местной скотобойне или из институтского вивария, растительное сырье можно приобрести на рынке, а микроорганизмы (за исключением
&
36
Глава 2
Рис. 2.1. Рост микроорганизмов на богатой питательной среде. Конец логарифмической фазы перед замедлением роста клеток является оптимальным периодом сбора клеточной массы, дающим самый высокий выход.
