Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 9

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 3 4 5 6 7 8 < 9 > 10 11 12 13 14 15 .. 145 >> Следующая

1.4. НЕКОТОРЫЕ ПРИЕМЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С БЕЛКОВЫМИ РАСТВОРАМИ
В последнем разделе этой вводной главы, посвященной общим методам, приведены некоторые сведения об обращении с белковыми растворами. В гл. 6 обсуждаются специальные методы, позволяющие сохранять стабильность фермента и его активность. Очень часто в распоряжении исследователя бывает раствор белка, который еще непригоден для фракционирования. Он может быть в неподходящем буфере, иметь не то значение pH, содержать слишком много соли, быть слишком разбавленным или слишком мутным. Мутность указывает на наличие нерастворимых частиц, которые можно отцентрифугировать или1 отфильтровать, как описано в разд. 1.2. Значение pH можно' легко изменить с помощью рН-метра, добавляя к раствору не очень сильную кислоту или щелочь (разд. 6.1). Концентрирование растворов и способы замены буферов описаны в данном разделе более подробно.
Концентрирование
Концентрированные растворы можно легко разбавить, однако обратный процесс ограничивается условиями, налагаемыми вторым законом термодинамики. Концентрировать растворы белков можно по-разному; выбор наилучшего способа зависит от особенностей применения концентрируемого белка и предъявляемых к нему требований. Концентрирование можно проводить путем осаждения белкового раствора с последующим растворением осадка в меньшем объеме. Обычно при этом используют сульфат аммония, хотя иногда применяют и ацетон (разд. 3.4). Растворенный осадок содержит осадитель, который необходимо удалить. Методы осаждения пригодны только для растворов, содержащих белки в концентрации выше 1 мг/мл; белки в более низкой концентрации или не осаждаются, если их растворимость недостаточна низка, или денатурируют в про-'цессе агрегации. Однако из этого последнего правила существует много исключений, так как некоторые белки в разбавленном растворе обладают по сравнению с другими более высокой стабильностью.
Адсорбцию белков, например, на ионообменнике можно использовать для успешного концентрирования их из очень раз* бавленных растворов (если нужный фермент адсорбируется
Лаборатория очистки ферментов
27
Рис. 1.13. Ультрафильтрация белковых растворов. А. Подвешенный диализный мешок сообщается с внешней атмосферой, а в колбе создается вакуум, так что максимальная разность давлений составляет менее 1 атм. Б. Ячейка для ультрафильтрации может работать при давлении до 5 атм. Фильтрат продавливается сквозь мембрану.
полностью, неважно, адсорбируются ли при этом другие белки). Например, очень разбавленный белковый раствор, элюированный с ДЭАЭ-целлюлозы при низкой ионной силе и pH 6, можно адсорбировать на маленькой колонке с ДЭАЭ-целлюло-зой, повысив pH раствора до 8, а затем элюировать белок небольшим объемом солевого раствора.
Наиболее важные методы концентрирования разбавленных растворов белков заключаются просто в удалении воды и низкомолекулярных веществ. Это может быть достигнуто с помощью различных приемов, основанных на применении полупроницаемых мембран (диализ) или на принципах гель-фильтрации; при этом белки не проходят через мембрану или какую-то поверхность, через которую вода и малые молекулы проходят. Наиболее часто используемой системой является ультрафильтрация, при которой вода принудительно проходит через мембрану, а по другую сторону мембраны остается более концентрированный раствор белка. Это достигается либо снижением давления, чтобы «отсосать» воду (рис. 1.13,Л), либо, чаще, применением сжатого воздуха или азота при давлении до 5 атм в специальных ячейках с перемешиванием раствора для предотвращения закупорки мембраны (рис. 1.13, Б). Последний метод при правильном использовании позволяет снизить объем с 50
28
Глава 1
до 5 мл или с 200 до 10 мл в течение 1 ч и даже быстрее. Ультрафильтрация особенно эффективна, если конечная концентрация белка остается относительно низкой. Скорость ультрафильтрации очень быстро падает с повышением концентрации белка.
Для быстрого концентрирования можно использовать сухой гель-фильтрующий материал, который при набухании исключает белок. Так как невозможно удалить весь белковый раствор с поверхности частиц без промывания (приводящего к разбавлению), этот метод пригоден лишь в тех случаях, когда более важное значение имеет концентрация раствора, а не выход белка. В лучшем случае можно ожидать, что потери белка составят 10—15%* Например, при обработке 100 мл раствора 20 г сухого сефадекса G-25 порошок быстро набухает и поглощает воду, занимающую практически весь объем геля. После отсасывания набухшего геля получают около 30 мл раствора, содержащего около 80% исходного белка, сконцентрированного приблизительно вдвое. Это весьма удобный метод, если необходимо быстро сконцентрировать уже концентрированный раствор, однако при очистке ферментов он обычно не применяется из-за потерь белка.
Еще один метод концентрирования состоит в удалении воды за счет осмотических сил. Образец помещают в диализный мешок, который затем погружают в раствор или порошок, оттягивающий воду из мешка. Обычно для этого используют поли-этиленгликоль (мол. масса 20 000) или высокозамещенную карбоксиметилцеллюлозу. Оба этих полимера очень сильно поглощают воду, поддерживая низкую активность воды снаружи мешка и высокую внутри. Фирма Calbiochem выпускает эти вещества под названием «Aquacide». Они очень удобны при работе с небольшими объемами: в течение 1 ч раствор объемом
Предыдущая << 1 .. 3 4 5 6 7 8 < 9 > 10 11 12 13 14 15 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed