Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
До широкого внедрения в практику метода гель-фильтрации диализ был рутинной стандартной процедурой, почти всегда применявшейся при очистке белков. Хотя этот метод отличается простотой и не требует сложного оборудования, он имеет два больших недостатка: необходимость замены диализата, причем часто в неудобное время, и относительную длительность процедуры. Вопрос о том, насколько важно проводить все операции достаточно быстро, обсуждается в разд. 7.1. За исключением тех случаев, когда диализ ставят на ночь, т. е. в то время, когда другие работы, как правило, не выполняются, во всех остальных случаях использование гель-фильтрации оказывается предпочтительным. Этим методом достигается быстрое и полное разделение белков, особенно при работе с небольшими объемами.
Принципы, на которых основана гель-фильтрация, хорошо известны, и не стоит описывать их здесь подробно. Удаление солей и замена буфера происходят в соответствии с принципом «все или ничего». Выбранный носитель полностью исключает белки, но удерживает низкомолекулярные вещества. Сефадекс
32
Глава 1
Таблица 1.2. Размеры колонок для обессоливания белковых растворов < помощью сефадекса G-25
Размеры ко Тип носи Объем ко Объем об Нормальная Обычное
лонки [пло теля лонки, CMS разца, см5 скорость время за
щадь попе потока, вершения
речного се мл • ч-1 процесса
ления (см2)Х (появление
Хвысота белка), мин
(см)]
1X8 Тонкий 8 1---1,5 40 7
6X10 ' Средний 60 2---10 200 15
8X30 Средний 240 10---30 250 30
8X60 Средний 480 30---80 250 45
16X90 Г рубый 1440 80---300 500 90
50ХЮ0 Грубый 5000 300---1000 1500 90
<3-25 — это, вероятно, наиболее широко применяемый для данной цели материал. Биогель Р-30 обладает приблизительно теми же свойствами. Быстрое «обессоливание» образца можно осуществить в один прием, пропустив его через колонку, предварительно уравновешенную требуемым буфером. При этом объем образца не должен быть больше Vs объема колонки. Хорошее разделение достигается, если скорость элюции составляет не более 50 см/ч (обратите внимание, что 50 см/ч равно 50 мл/ч на 1 см2 поперечного сечения). Для того чтобы легко « без задержки проводить обессоливание или замену буфера в -образце, необходимо иметь в своем распоряжении ряд заранее подготовленных колонок. В табл. 1.2 дается перечень колонок, которые обычно используются в нашей лаборатории. Чтобы разделение оставалось оптимальным, маленькие колонки следует набивать более мелкодисперсными адсорбентами.
Концентрация солей или белка в образце не должна быть слишком высокой, если требуется оптимальное разделение. Осадок белка, полученный с помощью сульфата аммония, растворяют в минимальном объеме буфера, а перед обессоливанием на колонке этот раствор следует развести буфером по крайней мере в два раза; концентрация белка в растворе должна быть не выше 30 мг/мл. Белок, выходящий из колонки, если он не окрашен и не регистрируется непрерывно на УФ-мониторе, может быть определен с помощью теста с трихлоруксусной или надхлорной кислотой. Присутствие сульфата аммония можно выявить в пробе с хлоридом бария (если буфер колонки содержит фосфат, используйте хлорид бария в НС1, чтобы не спутать осадок сульфата бария с осадком фосфата бария). Помните, что колонка для гель-фильтрации должна быть предварительно уравновешена буфером, который будет замещен белком. Объем буфера, которым уравновешивают колонку перед нанесени-
Лаборатория очистки ферментов
33
ем образца, должен быть по крайней мере равен объему колон-ки. Однако не имеет значения, каким буфером промывают колонку, так как белок двигается перед фронтом растворителя. При использовании дорогих буферов колонку можно уравновешивать «обессоливающим» буфером, например очень разбавленным буфером трис — ЭДТА. Для его приготовления раствор кислой формы ЭДТА (~0,2 мМ) нейтрализуют трисом до pH 7,5—8. Такой буфер не оказывает вредного воздействия на белки, за исключением тех случаев, когда: а) ЭДТА инактивирует их, связывая незаменимый ион металла, или б) белки «всаливаются» (разд. 3.1) при очень низкой ионной силе и осаждаются в колонке. При условии что этого не происходит, состав буфера в выходящем из колонки растворе белка можно довести до нормального, добавив к нему, например, ОД1 объема концентрированного (ЮХ) буферного раствора.
Как и в случае диализа, конечный объем белкового раствора, вероятно, будет значительно больше, чем до «обессоли-вания»; тем не менее перед нанесением образца на адсорбционную колонку может потребоваться дальнейшее разведение (гл. 4). Смена буферов может быть осуществлена тем же способом, что и «обессоливание»; однако, если концентрация белка в растворе низка и объем достаточно велик, лучше предварительно провести «высаливание» белка, а затем растворить его в небольшом объеме буфера и обессолить на небольшой колонке.
