Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Хроматография возможна только в том случае (0</?/<1),. когда вещество задерживается в результате частичной адсорбции, но в конечном счете элюируется. Два вещества с очень близкими константами удерживания (/?/) могут быть разделены полностью только при использовании достаточно длинной
2*
20
Глава 1
Рис. 1.6. Принципы хроматографии. Л. Образец, нанесенный в центр кружка фильтровальной бумаги, при добавлении буферного раствора растекается в радиальном направлении и компоненты образца разделяются в виде колец в соответствии со значениями их /?/. Б. Одномерная бумажная хроматография дает разделение компонентов образца на полосы. В. Введение еще одного измерения, реализуемого в колоночной хроматографии.
колонки и при наличии не слишком большой продольной диффузии. Разделительная способность частично зависит от числа эффективных адсорбционных стадий, из которых состоит весь процесс разделения.
Вследствие того что нанесенный слой образца имеет определенную толщину, число стадий разделения, называемое числом теоретических тарелок, зависит от соотношения длины колонки к толщине слоя образца, а также от зернистости адсорбента и скорости диффузии. Так как любой образец, объем которого не превышает определенной величины, в результате диффузии распределяется примерно в одном и том же объеме, очень важно правильно определить ширину элюируемой фракции. Она зависит как от исходной толщины слоя образца, так и от степени диффузии по мере прохождения образца по колонке. Как мы увидим далее (гл. 4), при колоночной хроматографии обычно производится смена буферных систем, осуществляемая либо
Лаборатория очистки ферментов
21
1 см
ступенчато, либо с использованием градиента. В этих условиях концепция числа тарелок мало пригодна.
Колоночная хроматография — это главный метод разделения ферментов, позволяющий использовать огромное разнообразие адсорбентов. Некоторые адсорбенты обладают очень большой емкостью относительно тех или иных белков (>100мгХ Хсм~3), тогда как у других адсорбентов емкость может быть в 200 раз меньше указанной. Поэтому размеры колонок, необходимых для разделения, варьируют в широких пределах. Теоретически для идеальной системы форма колонки не имеет значения, так как отношение длины колонки к толщине слоя образца остается неизменным, если объемы адсорбента и образца не меняются (рис. 1.7). Однако размер частиц весьма важен; более тонкое разделение белков достигается при «прохождении» ими большего числа частиц адсорбента, что соответствует большему числу теоретических тарелок. Таким образом, при данном размере частиц адсорбента более длинная колонка имеет определенные преимущества. С другой стороны, в колонке большого диаметра можно использовать более мелкие частицы, так как уменьшение скорости протекания через каждый квадратный сантиметр, обычно неизбежное для таких плотных адсорбентов, компенсируется большим поперечным сечением колонки. На практике, однако, предпочитают использовать более длинные колонки, поскольку идеальные условия работы не соблюдаются, а поток не является достаточно равномерным (см. рис. 5.8 и 5.9). Это приводит к увеличению продолжительности процесса, что может быть нежелательным. В лаборатории должны быть колонки разной емкости (от 1 см3 до 2 л) и разной формы (от коротких, в которых диаметр приблизительно равен высоте, до длинных, в которых диаметр составляет около 1/30 высоты), и всем им находится применение.
22
Глава 1
Конусообразная поверхность, облегчающая равномерное распределение буфера по поверхности адсорбента
Найлоновая сетка
Небольшое "мертвое" пространство (его наличие не обязательно}
Адсорбент рис j g Схема типичного
аппликатора для колоночной хроматографии.
Самые лучшие колонки снабжены специальными устройствами для выравнивания верхней и нижней поверхностей носителя, так что равномерный поток жидкости, протекающей вниз по колонке, не нарушается на ее концах. Эффективная пористая сетка или диск на дне колонки дают возможность раствору свободно вытекать в сборное пространство, которое должно иметь минимальный объем, так как это уменьшает смешивание фракций. Для этой же цели во время нанесения образца и последующей элюции буферные растворы следует очень ровно распределять по поверхности носителя (рис. 1.8).
В учебной лаборатории, где работают десятки студентов, по экономическим соображениям невозможно снабдить каждого из них такой колонкой. При работе с малыми объемами можно использовать такие простые и дешевые системы, как пастеровская пипетка с тампоном из стеклянной ваты в месте сужения трубки (рис. 1.9, А), шприц с поршнем или без него, имеющий на дне перфорированный пластиковый диск (рис. 11.9, Б), или простая стеклянная трубка с резиновой пробкой, вставленной в один из ее концов, и каким-либо фильтром типа пористого диска или слоя фильтровальной ткани, обеспечивающим равномерный сбор элюата (рис. il.9, В). Неравномерный ток жидкости на поверхности носителя может быть причиной ее неравномерного протекания через колонку. Небольшой слой жидкости над адсорбентом позволяет устранить все эти нарушения, если адсорбент представляет собой хорошо уплотняющийся материал и его поверхность не повреждается при перемещении над ней буфера; несколько примеров неравномерного протекания жидкости через колонку показано на рис. 1.10. Так как большинство белковых растворов бесцветны, часто не обращают внимания на тс, что колонка работает плохо.
