Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Предисловие
9
новые материалы или методы, разработанные уже после появления оригинальной публикации. При подборе условий полезно многократно изменять различные параметры до тех пор, пока не будет найдено идеальное их сочетание. На это уходит много времени, но в итоге затраченные усилия оправдываются, так как вы можете быть уверены в воспроизводимости методики, если известны пределы, в которых допустимо изменение условий на каждом этапе.
В заключение мне бы хотелось выразить благодарность многим студентам и преподавателям Университета Ла Тробе за их долголетнее участие в совместной работе.
Я хотел бы также поблагодарить проф. К. Мосбаха, д-ра К. Р. Лоу, д-ра И. П. Трайера, д-ра К.-И.Ли и д-ра Ф. фон дер Хаара за предоставление оттисков и препринтов их работ по очистке ферментов. Я благодарен Австралийскому комитету научно-исследовательских фондов за финансовую поддержку.
Бандора, Виктория Австралия
Роберт К. Скоупс
ГЛАВА 1
ЛАБОРАТОРИЯ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ
Эта глава знакомит читателя с основными методами и оборудованием, применяемым при очистке ферментов. Проводить очистку ферментов можно с помощью сравнительно простого оборудования; к предметам первой необходимости относятся лишь центрифуги и УФ-спектрофотометр. Конечно, использование более сложного оборудования и автоматических систем значительно облегчает жизнь, но требует больших расходов. В этой книге не раз будет подчеркиваться, что выделение ферментов следует проводить без промедления. Любая процедура, основанная на применении медленно функционирующего, ненадежного или не всегда доступного оборудования, чревата опасностью потерять фермент. Используя только сравнительно простые и обычные приборы, можно, как правило, работать без задержек. Мысль ясна — всегда следует сначала использовать самые простые приемы и только в случае неудачи прибегать к специальным методам.
1.1. ОБОРУДОВАНИЕ, СПЕЦИАЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ
Существует множество сложных и тонких приспособлений, предназначенных для разделения белков, и так же, как в любой другой сфере жизни, оборудование в этой области все более автоматизируется ради удобства и простоты в обращении. Однако, по мере того как приборы усложняются, превращаясь, по существу, в «черные ящики», контролируемые микропроцессорами, мы все более удаляемся от реальности происходящего и в какой-то степени все меньше контролируем то, что хотим делать. Большая часть сложнейшего оборудования предназначена для надежного воспроизведения рутинных операций и потому не всегда пригодна для разработки новых методов. Но, помимо этих соображений, необходимо принимать во внимание и стоимость такого оборудования; часто полезнее приобрести
Лаборатория очистки ферментов
11
два дешевых прибора вместо одного самого дорогостоящего; средства, потраченные на простейшие приспособления, такие, как пипетки, пробирки, стаканы, скорее окупятся, чем затраты на оборудование, предназначенное для очистки какого-то одного белка, так как оно будет использоваться не очень часто и к тому же может прийти в негодность.
Остается сказать о том минимуме основного оборудования, который должна иметь в своем распоряжении каждая лаборатория по очистке ферментов. Активность ферментов обычно измеряют с помощью спектрофотометрических или радиохимических методов. Если все определения проводят спектрофотометрическим способом, то можно обойтись и без сцинтилляционно-го счетчика. Спектрофотометр же обязательно должен быть в лаборатории, так как он требуется, кроме того, и для измерения концентрации белков (разд. 8.5). К оборудованию первой необходимости относится спектрофотометр с УФ-лампой, желательно с самописцем для записи хода реакций во времени.
При очистке ферментов лишь в редких случаях можно избежать центрифугирования. В промышленных масштабах для отделения осадка обычно используют фильтрационные системы, но в лаборатории более удобна центрифуга. Принципы и методы центрифугирования изложены ниже (разд. 1.2). В большинстве случаев нужна стандартная постоянно работающая центрифуга с охлаждением до 0°С или немного ниже; при этом эффективность центрифугирования, выражающаяся произведением относительной величины g на емкость в литрах, должна быть порядка 10 000—il5 000. Можно использовать множество центрифуг других типов — от настольных до препаративных ультрацентрифуг. Но они не всегда нужны и вряд ли будут применяться при очистке ферментов так же часто, как типовая центрифуга, описанная выше.
Колоночная хроматография настолько широко распространена, что в лаборатории совершенно необходимо иметь соответствующее оборудование. Разделение на колонке можно проводить и с помощью самодельной стеклянной трубки или шприца (разд. il.3), а фракции собирать вручную и затем спектро-фотометрировать каждую пробирку. Однако работа идет намного эффективнее и с меньшими затратами труда при использовании автоматизированного устройства, которое стоит примерно столько же, сколько спектрофотометр, но дешевле центрифуги. Набор таких приспособлений состоит из колонок разных размеров, коллектора фракций с УФ-приставкой, перистальтического насоса и магнитной мешалки (для создания градиента). Необходимо иметь в своем распоряжении колонки разной формы и размера, чтобы можно было использовать для набивки колонки оптимальное количество адсорбента, соответ-
