Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Для удаления комков, волос, грязи, нерастворимых солей, и т. д. используют фильтрацию через бумагу Whatman № 54, причем эта процедура обязательно должна предшествовать работе на колонке. Перед нанесением белкового раствора на колонку можно провести также центрифугирование.
Последним достижением в области крупномасштабной ультрафильтрации (с применением давления для продавливания раствора через мембрану, задерживающую крупные частицы) является кассетная система «РеШсоп», выпускаемая фирмой Millipore. Эта установка, в которой общая площадь фильтра составляет не менее 2 м2, задерживает мелкие частицы, причем скорость фильтрации достигает il л/мин. Систему «РеШсоп» очень удобно использовать для концентрирования микроорга-
Лаборатория очистки ферментов
15
низмов перед тем, как центрифугировать их с целью получения плотного осадка. В результате фильтрации получается не «паста», а просто более концентрированная суспензия.
Центрифугирование
Центрифугирование основано на седиментации частиц в возрастающем гравитационном поле. Силы, действующие на частицу, показаны на рис. 1.3. Для твердых сферических частиц время, необходимое для осаждения частицы в данной среде от мениска до дна пробирки, выражается следующей формулой:
(1.1)
/ = _L 1 2
______J________in^L
2coV2 (р — ро) xt •
где xt — расстояние от оси вращения до мениска, Хь— расстояние от оси вращения до дна пробирки, остальные символы даны в подписи к рис. 1.3. Таким образом, t прямо пропорционально вязкости и обратно пропорционально разности плотностей, квадрату радиуса частицы и квадрату угловой скорости. Остальные факторы представляют собой геометрические параметры для данного ротора. Отсюда видно, что если радиус частицы при прочих равных условиях уменьшается в два раза, то угловая скорость должна увеличиться тоже в два раза, для того чтобы осаждение частицы заняло столько же времени. Более важной величиной является разность плотностей; она вели-
Ось
Рис. 1.3. Силы, действующие на частицу в роторе центрифуги. Обозначения: т — масса частицы, р — плотность частицы, р0 — плотность раствора, а> — угловая скорость ротора, rj — вязкость раствора, г — стоксовский радиус ча* <стицы.
16
Глава 1
ка для водных растворов низкой концентрации, но, когда концентрация соли приближается к той, которая требуется при высаливании белков (разд. 3.3), эта разность может быть очень мала. Плотность безводных белков составляет около 1,34, а агрегированные белковые частицы содержат примерно 50% белка и 50% связанного раствора. Таким образом, р белкового агрегата в воде составит 72(1.34+1) = 1,17(р—ро — 0,17), тогда как в растворе сульфата аммония при 80%-ном насыщении р будет близко к 1,27; при этом р0 = 1,20 (р—ро=0,07). С другой стороны, плотность 33%-ного ацетона равна 0,93, и, следовательно, (р—'ро) равно 0,20, т. е. даже больше, чем в чистой воде. Этот пример иллюстрирует преимущества использования органических растворителей для осаждения белков (разд. 3.4), особенно в случае плотных вязких растворов; осаждение при этом происходит быстрее.
При очистке фермента оптимальным считают центрифугирование, при котором получают плотный осадок и прозрачную надосадочную жидкость; для этого можно пойти на увеличение времени центрифугирования. Осадки, полученные высаливанием, изоэлектрическим осаждением, осаждением в органических растворителях и другими методами, описанными в гл. 3, обычно центрифугируют при 15 000 g в течение 110 мин или при 5000 g в течение 30 мин. Следует отметить, что при работе с малыми объемами центрифугирование при 5000 g в течение 30 мин может дать удовлетворительные результаты, если расстояние от мениска до дна пробирки равно 5 см. При работе же с большими объемами, когда это расстояние может достигать 20 см, 30 мин иногда недостаточно. Выше указаны лишь приблизительные величины g, так как при данной скорости вращения g возрастает по мере оседания частиц. Однако, если говорить не о величине g, а о скорости вращения и, из уравнения (1.1) следует, что время осаждения зависит не от абсолютной длины пути осаждаемой частицы, а от логарифма соотношения Хь и Xt. Эта величина лишь незначительно варьирует в разных центрифугах. Поэтому центрифугирование при 5000 об/мин в течение 30 мин дает сходные результаты во всех центрифугах.
Размер частицы является критическим фактором, определяющим скорость и продолжительность центрифугирования. При любом процессе осаждения приходится иметь дело с частицами самых разных размеров, но величины, указанные выше, обычно бывают достаточны для осаждения всего агрегированного белка, образующего видимую мутность; невидимые в растворе более мелкие белковые агрегаты не осаждаются. Однако многие клеточные органеллы и образующиеся из них фракции ни в коей мере не представляют собой чистый белок. Они
Лаборатория очистки ферментов
1Г
могут содержать много липидного материала, который резка> снижает значение (р—ро) в уравнении (1.1). Это значение может стать даже отрицательным, и в этом случае частицы поднимутся на поверхность в виде флотирующего слоя.
