Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Технология рекомбинантных ДНК в принципе позволяет выделять в чистом виде и в достаточном количестве любой ген и при наличии подходящего вектора или иным способом встраивать этот ген (или гены) в состав хромосомной ДНК и добиться его экспрессии. Мы будем рассматривать генетическую инженерию в плане использования технологии рекомбинантных ДНК для создания новых генотипов, а значит, и форм растений. Применение этой технологии делает поиск целенаправленным и значительно расширяет возможности манипулирования генетическим аппаратом при сокращении времени получения новых форм растений.
Важным преимуществом растений по сравнению с животными является то обстоятельство, что клетки растений в культуре обладают свойством тотипотентности, т. е. при наличии
подходящих условий по крайней мере часть клеток может развиться в целое растение. Таким же свойством обладают и растительные протопласты — клетки, лишенные целллюлозной оболочки.
Какие же гены нужно клонировать и вводить в растения, чтобы их улучшить? Наиболее целесообразно приобретение следующих признаков: устойчивость к холоду, засухе, повышенной засоленности почвы, т. е. к стрессовым воздействиям внешней среды, также полезна устойчивость к вредителям, гербицидам и пестицидам, резистентность к болезням, скороспелость и др. Определение и выделение генов, ответственных за эти признаки,— задача чрезвычайно трудная. Дело осложняется еще и тем, что геном растений изучен хуже, чем геном млекопитающих.
Другая проблема связана с введением и адекватной экспрессией генов. Здесь основная задача связана с созданием векторных молекул и с разработкой метода прямого переноса генов. Сюда же входит задача отбора трансформированных клеток и обеспечение стабильного наследования приобретенного признака. Решение этих задач существенно облегчается в связи с обнаружением природного генного вектора, возникшего в результате эволюции почвенных бактерий.
Наконец, третья проблема касается регенерации трансформированных клеток или протопластов в целое фертильное растение. Дело в том, что регенерацию удалось получить для двудольных растений. Только для некоторых хозяйственно полезных растений удалось наладить методический цикл от протопласта до растения. Это картофель, люцерна, томаты, морковь, табак, капуста и др. Что же касается злаков, то регенерацию их клеток пока надежно осуществить не удалось.
Мы перечислили основные проблемы, которые «лежат на поверхности», и трудно предсказать, какое множество препятствий встанет на пути исследователей.
Векторы на основе Ti-плазмид. Некоторые виды бактерий из группы агробактерий (Agrobacteria) могут заражать растения и вызывать при этом образование опухолей — корончатых галлов. Опухоли состоят из недифференцированных клеток, интенсивно делящихся и растущих в месте заражения. Почти все двудольные растения чувствительны к бактериям, а злаки и другие однодольные — нет. При культивировании клетки опухоли могут расти в отсутствие гормонов, необходимых для роста нормальных растительных клеток. Если убить все бактерии антибиотиком, то клетки корончатых галлов сохраняют трансформированный фенотип. На примере одного из самых сильных индукторов опухолей — Agrobacterium tumefacien.se— было пока-194
Рис. 3.17. Т-ДНК, интегрируя в хромосому растения, индуцирует образование опухоли (корончатого галла)
зано, что собственно опухолеродным агентом является плазмида, часть которой встречается в хромосомах клеток растения (рис. 3.17).
После трансформации клетки растения начинают синтезировать необычные аминокислоты — опины, которые используются бактериями в качестве источника азота и углерода. Таким образом образование опухоли сопровождается перестройкой метаболизма клеток, и они начинают синтезировать соединения, необходимые только для бактерий.
Плазмиды, вызывающие опухоли, называются Ti-плазмида-ми (от англ. tumor inducing — инициирующие опухоль). Это кольцевые молекулы длиной около 200 кб (3—5% от размера хромосомы агробактерии). В бактериальных клетках они реплицируются автономно. Ti-плазмиды различают по типу синтезируемого опина. Чаще всего встречаются плазмиды, кодирующие нопалин или октопин, причем клетка может содержать только один тип плазмиды: либо октопиновую, либо нопалиновую.
Генетические исследования показали, что гены, ответственные за индукцию опухоли, синтез опинов и подавление диффе-ренцировки, расположены близко друг от друга и входят в состав Ti-области плазмиды, которая встраивается в хромосому клетки при инфекции. Т-сегмент имеет длину около 20 кб (10% Ti-плазмиды) и встраиваются в различные, по-видимому неспе-Цифичные, области хромосомы. На Т-области картировано семь генов, каждый из которых регулируется собственным промотором. Эти гены отвечают за синтез опина и за подавление диф-ференцировки клеток (подавление образования корней и побегов). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и
Рис. 3J8, Структура Ti-плазмид;
/ — область вирулентности; 2 — морфология опухоли; 3—синтез октопина или иопалина; 4 — распад нопалина; 5—распад агро-ципопина,- 6—распад агролииа
