Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Аналогичный метод разработан для анализа клеточных мРНК с целью выяснения их полного или частичного соответствия зонду, а также для определения их числа. Метод называется «Северный блотинг». Здесь электрофорез проводят не с фрагментами ДНК, а с молекулами РНК, которые в присутствии формальдегида также разделяются по размерам, а потом гибридизуются с зондом. Метод является полезным дополнени-
Электрофорез в агарозном геле
Рис. 3.14. Принцип эксперимента по блот-гиб-ридизации (по Саузерну)
ем к технике клонирования ДНК, так как позволяет определить степень соответствия специфической ДНК зонду.
Итак, в совокупности описанные методы в том или ином сочетании позволяют получить практически любой ген, продукт которого — белок — известен и может быть выделен хотя бы в малом количестве. Этот ген в дальнейшем может стать объектом генно-инженерных манипуляций, задача которых получить его экспрессию в новом генетическом окружении.
3.4. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ
Генетические элементы, регулирующие экспрессию генов.
Многие бактериальные гены устроены таким образом, что они способны функционировать с существенно разной эффективностью. У Е. coli, например, относительное содержание различных белков варьирует в очень широких пределах (от менее чем 0,1% до 2%) в зависимости от их функций; при этом каждый белок в хромосоме Е. coli кодируется единственным геном. Такие вариации обусловлены действием системы контроля генной, экспрессии, которая осуществляется главным образом на уровне транскрипции ДНК. Таким образом, чаще всего уровень активности гена связан с количеством синтезируемой на нем мРНК, т. е. с активностью фермента РНК-полимеразы.
Последовательности ДНК, расположенные перед началом структурного гена и определяющие степень активности РНК-полимеразы, называются регуляторными последовательностями (рис. 3.15). Одна из таких последовательностей представляет собой участок ДНК, с которым связывается РНК-полимераза. Этот участок называется промотором. Последовательность оснований промотора определяет частоту инициации синтеза мРНК, причем замена одного основания в этой последовательности может привести к уменьшению частоты инициации в 1000 раз.
Регуляция экспрессии у Е. coli происходит также и на уровне трансляции. Последовательность оснований длиной 6—8 нуклеотидов, расположенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУГ, определяет эффективность трансляции. Эта последовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой. Как правило, он отстоит на 8 нуклеотидов от инициирующего кодона, и его сдвиг в ту или иную сторону может резко снижать эффективность трансляции соответствующей мРНК. Описанный участок называется последовательностью Шайна — Дальгарно, по имени исследователей, впервые его идентифицировавших.
а)
—80до-70
мРНК—¦>
—30 ДО-25 fcа
~1—Г-------------1-1---ГТ1—--------
jGCfeAATCTj I ТАТА-рАд j ДНК
'CAT-бокс' “ТАТА- Сигнал начала
бокс' транскрипции
б) t ААТААА С
ДНК
Транскрипция^Сигнал присоединения
мРНК
мРНК
I ро1у(А)-попимераза cogegaU^^^^^^^^AAUAAA^ даддаддадд Рис. 3.15. Сигналы инициации (а) и терминации (б) транскрипции у эукарнот
У эукариотических организмов механизм регуляции транскрипции гораздо более сложен. В результате клонирования и секвенирования генов эукариот обнаружены специфические последовательности, принимающие участие в транскрипции и трансляции. Эти последовательности по своей первичной структуре и расположению относительно инициирующего кодона отличаются от прокариотических, и бактериальная РНК-полимераза их не «узнает». Таким образом, для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены находились под контролем прокариотических регуляторных элементов. Это обстоятельство необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии.
Экспрессируемые векторы. Экспрессия генов в бактериях. Для конструирования рекомбинантной ДНК, содержащей в своем составе ген, который должен экспрессироваться, придерживаются следующей стратегии. Синтезируют кДНК или из клонотеки выделяют клетки, несущие фрагмент генома с нужным геном, и клонируют их в соответствующем векторе. Фрагменты геномной ДНК подвергают модификации — удаляют из них некодирующие области и участки соседних генов. Часто для проведения этой операции необходимо секвенирование данного фрагмента ДНК. Затем конструируются промежуточные рекомбинантные ДНК, в которых ген помещается под контроль бактериальных регуляторных элементов (промотор, оператор, точка связывания с рибосомами). Эти регуляторные элементы
EcoRi выделяют специально для
