Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
ность эндосперм-бокса, синтезируется только в семенах или зернах.
Таким образом было определено значение этой 25-нуклео-тидной последовательности для синтеза запасных белков, а также необходимость включения ее в состав трансформационных векторов, содержащих модифицированную последовательность генов проламиновых белков с целью их последующего депонирования в семенах или зернах.
Рассмотрим следующий этап в получении трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка на примере модифицированного а-зеина кукурузы. Дополнительные кодоны в последовательность гена вводили с помощью олиго-нуклеотиднаправленного мутагенеза. Впервые такая работа была проведена по введению кодонов лизина в последовательность гена, и как раз на гене а-зеина. Теперь такое введение новых триплетов является довольно обычным.
После модификации нуклеотидной последовательности гена а-зеина следовало соединение всех частей в вектор для трансформации. Это осуществлялось с использованием рестриктаз, вырезающих необходимые фрагменты гена, в нашем случае модифицированного гена а-зеина, из клона геномной библиотеки, и промотора, в данном случае это промотор р-фазолинового гена. Кроме того, в состав конструкции входила последовательность эндосперм-бокса. Соединение этих фрагментов ДНК и клонирование в вектор происходило с использованием ДНК-лигазы.
Кроме того, в состав вектора должен входить ген-маркер, по которому будет вестись селекция. В наиболее часто используемых конструкциях таким маркерным геном является ген KmR, определяющий устойчивость к антибиотику канамицину. Наличие маркерного гена необходимо для того, чтобы на ранних стадиях можно было отобрать только те растения, в геном которых был интегрирован вектор, так как невозможно отличить на стадии каллуса или ранних этапов регенерации трансформированные растения от нетрансформированных. Если трансформацию проводят с помощью агробактерии, то выбираются векторные системы на основе Ti-плазмиды и интересующий нас ген вместе с геном-маркером встраивается в область Т-ДНК.
Таким образом, в Т-ДНК область вектора входит модифицированная последовательность гена а-зеина с промоторной областью, маркерный ген KmR, определяющий устойчивость к канамицину, и повторы правой и левой границы, фланкирующие Т-ДНК. Векторную конструкцию вводят в клетки агробактерии. 206
Трансформация растительных клеток табака происходит при кокультивировании фрагментов листа табака и агробактерии, в результате чего происходит встраивание векторной конструкции с модифицированным геном зеина в отдельные клетки мезофила листа. Затем фрагменты листьев табака переносятся на среду для регенерации. Введение в состав среды для регенерации растений-трансформантов антибиотика канамици-на приводит к выживанию только тех растений, геном которых содержит векторную последовательность модифицированного гена запасного белка и гена-маркера. Полученные растения-трансформанты, отобранные на селективной среде с антибиотиком, анализируют на присутствие векторной конструкции методом блот-гибридизации и определяют уровень экспрессии модифицированного белка.
Таким образом были получены растения табака, трансформированные геном модифицированного а-зеина кукурузы, обогащенного лизином (рис. 3.21). Модифицированный белок ак-
LB
---
Т т-щ
Рг Э-Б I I I
Рг
Т-ДНА р-фазопина а-зеин
Km
____BEL_______
т-днк4—
а-зеин Km
Анализ трансформантов методом :
,блскт-гибридизации на присутствие в геноме вектора синтеза модифицированного белка
Рис. 3.21. С хема получения трансгенного растения табака с интегрированным геном а-зенна, обогащенного лейциновыми кодонами
I — трансформации агробактерии, 2 — трансформация растительных клеток; 3—селективная срела с антибиотиком канамицином, 4 — регенерация
тивно синтезировался в семенах, трансформированных этим вектором растений кукурузы, с получением линий кукурузы с улучшенным качеством зерна. В дальнейшем такие трансгенные линии могут использоваться при выведении новых сортов методами классической селекции.
Эксперимент по трансформации пшеницы геном высокомолекулярной субъединицы белка глютенина с измененной последовательностью показал, что введение в геном растения модифицированного гена проламина приводит к активному синтезу модифицированного белка и влияет на состав и уровень соответствующих запасных белков, что, в конечном итоге, привело к улучшению хлебопекарного качества пшеничной муки.
Одним из новых подходов к улучшению состава белков является конструирование химерных генов на основе генов запасных белков однодольных и двудольных. В качестве исходных генов были использованы ген гордеина В1 ячменя и легумина В4 бобов. Конструкцией, содержащей такой химерный ген, были протрансформированы растения табака и получены трансгенные линии.
Таким образом становится реальной возможность манипулирования белковым составом эндосперма зерновых методами генетической инженерии.
3.8. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К СТРЕССОВЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ
