Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Вследствие сравнительно малого размера генома и короткого времени регенерации (несколько часов) экспериментировать с дрожжевыми клетками так же легко, как с большинством прокариот. Однако при этом можно исследовать весьма сложные генетические процессы, характерные для эукариот.
Процедура введения ДНК в клетки дрожжей не представляет сложности. Целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами и получают так называемые «сферопла-сты». Их инкубируют с ДНК в присутствии СаС12 и полиэти-ленгликоля. При этом мембрана становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкубация сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку.
Поскольку ряд генов дрожжей способен комплементировать мутации Е. coli, удалось достичь больших успехов в клонировании генов дрожжей. Для этого тотальную ДНК дрожжей после обработки рестриктазой клонируют в плазмиде и затем трансформируют этими плазмидами клетки Е. coli, несущие соответствующие мутации. Среди полученных трансформантов нетрудно отобрать те плазмиды, которые несут ген, комплемен-тирующий мутацию. Затем плазмиды можно использовать для трансформации сферопластов мутантных штаммов дрожжей.
Однако использование челночных векторов позволяет комплементировать мутации в самих дрожжевых клетках. Сконструированные челночные векторы содержат дрожжевой селективный маркер (Leu 3, his 3, ига Зит. п.), дрожжевой репликатор, обеспечивающий репликацию плазмиды в дрожжах, и бактериальный репликатор. Наиболее распространенные дрожжевые репликаторы выделены из 2 мкм-плазмиды дрожжей, хромосомной ДНК и митохондриальной ДНК.
Дрожжевую ДНК, расщепленную подходящей рестриктазой, клонируют в челночном векторе и размножают в Е. coli. Сферопласты дрожжей трансформируют смесью полученных плазмид. Плазмиды, комплементирующие мутацию в сферо-пластах-реципиентах, в селективных условиях можно отобрать, затем выделить и клонировать в Е. coli в больших количествах. Таким путем можно клонировать любой ген, для которого идентифицированы мутации.
С помощью челночного гена удалось ввести гены лейкоцитарного интерферона человека в клетки дрожжей. Уже сконструирован штамм дрожжей, который выделяет в культуральную среду почти чистые а-, Р- и у-интерфероны. Для биологической активности интерферонов, которые представляют собой глико-протеины, существенно наличие углеводных групп. Клетки дрожжей, подобно клеткам млекопитающих, способны синтезировать такие группы и присоединять их к белковым молекулам. Бактериальные клетки таким свойством не обладают. Таким образом экспрессия генов млекопитающих значительно облегчает получение функционально активного продукта.
Один из наиболее эффективных методов введения чужеродного гена млекопитающего состоит в том, что этот ген, предварительно клонированный в бактериальных клетках, переносят не в микроорганизмы, а в клетки млекопитающего, растущие е культуре. Хотя культуры клеток животных, особенно при мае-совом выращивании, гораздо менее экономичны, чем бактериальные дрожжевые культуры, они обладают существенным преимуществом — способностью осуществлять мелкие, но весьма важные модификации белков — продуктов гена млекопитающих. Например, для эффективного функционирования ряда белков необходимо присоединение к ним цепочек из молекул углеводов или липидов. Образование и присоединение таких цепочек — обычный процесс для клеток млекопитающих, тогда как бактериальная клетка не способна производить подобные модификации.
Трансфекция. Эффективной трансформации клеток млекопитающих очищенной ДНК удалось достичь при добавлении к трансформирующей ДНК ионов Са. Предполагают, что клетки преимущественно поглощают частицы кальциевого преципитата ДНК по механизму фагоцитоза, а затем небольшая часть проникших в клетку молекул стабильно интегрирует с хромосомой ДНК- Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, необходима разработка метода маркера. Был разработан метод получения клеток, дефектных по гену тимидинкиназы (тк-клетки). При трансформации таких клеток ДНК, содержащей ген тимидинкиназы вируса герпеса, с частотой 1 на 10 (10) клетки приобретали ген тк и могли расти на селективной среде. Анализ методом блот-гибридизации (см. с. 180) подтвердил, что выжившие клетки содержали интегрировавший в геном тк-ген вируса герпеса.
Другой селективный маркер — ген, кодирующий дигидрофо-латредуктазу (ДГФР), можно использовать при трансформации немутантных линий клетки. Благодаря экспрессии многих копий этого гена животная клетка вместе с плазмидой приобретает устойчивость к высоким концентрациям ингибитора фермента, и, таким образом, трансформантов можно отбирать при высоких концентрациях ингибитора.
Разработано еще два универсальных вектора, содержащих генные маркеры, работающие в нормальных клетках. Они построены по одному и тому же принципу: прокариотические гены, определяющие фенотип трансфицированных клеток, соединены с эукариотическими регуляторными сигналами. Первый
вектор сконструирован путем встраивания клонированного бактериального гена, кодирующего ксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазу (КГФРТ), между промотором и сайтом полиадени-лирования гена большого Т-антигена вируса SW 40. Наличие этого гена позволяет клеткам расти на селективной среде, содержащей микрофеноловую кислоту и ксантин (нормальные клетки утилизируют ксантин с очень низкой эффективностью).
