Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Шевелуха Е.А. -> "Сельскохозяйственная биотехнология" -> 79

Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.

Шевелуха Е.А., Калашникова С.В., Дегтярев С.В., Кочиева Е.З. Сельскохозяйственная биотехнология — М.: Высшая школа, 1998. — 416 c.
Скачать (прямая ссылка): selskohoztehnika1998.djvu
Предыдущая << 1 .. 73 74 75 76 77 78 < 79 > 80 81 82 83 84 85 .. 180 >> Следующая

Наиболее перспективным в этом отношении и поэтому лучше изученным является вирус мозаики цветной капусты CaMV (cauliflower mozaic virus), поражающий в основном растения семейства крестоцветных. Частицы этого вируса имеют диаметр около 50 нм и содержат кольцевую ДНК длиной 8 кб. С вирионной ДНК транскрибируются не менее 80% информации,
и, по крайней мере, некоторые из образовавшихся РНК являются матрицами для синтеза белков.
Небольшой размер генома CaMV дает возможность манипулировать in vitro с вирусной ДНК, как с бактериальной плазмидой, и затем вводить ее в растения путем втирания в листья. Инфицирование небольшого числа клеток приводит к заражению всего растения, так как вирус быстро распространяется, передаваясь от клетки к клетке. При использовании 1—5 мкг клонированной ДНК для инфицирования одного растения посредством механической инокуляции достигается почти 100%-ная эффективность инфекции.
Для клонирования ДНК CaMV в Е. coli используют плаз-мидные векторы Е. coli, например, pBR 322. После обработки соответствующими рестриктазами ДНК CaMV и pBR 322 и лигирования образуется гибридная плазмида, способная к амплификации в Е. coli.
Прямая интеграция ДНК CaMV в геном хозяина после инфекции не показана. Разработан методический прием — агроинфекция, позволяющий осуществить прямое встраивание вирусной ДНК после инокуляции. Для этого геном CaMV встраивается в Т-ДНК и в ее составе интегрирует в ядерный геном различных растений.
К преимуществам векторных систем на основе вирусов можно отнести следующие: малый размер генома, что дает возможность легко манипулировать вирусной ДНК; высокая ко-пийность вирусной ДНК в клетках зараженных растений (до 50 ООО на клетку); наличие сильных промоторов, которые могут обеспечить эффективную экспрессию чужеродных генов.
Среди недостатков следует отметить небольшую емкость вектора (менее 800 н. п.) и ограниченный круг хозяев — крестоцветные. Емкость вектора можно увеличить до 800—1000 н. п., если инфицировать вирусом растительные протопласты. В этом случае инфекция не передается от клетки к клетке и нет необходимости в упаковке ДНК в частицы. Таким образом, часть вирусного генома, ответственная за упаковку в вирусные частицы, может быть удалена и замещена чужеродной ДНК-
В заключение следует отметить, что сильные вирусные промоторы могут использоваться для экспрессии чужеродных ге-
нов в других векторных системах. Например, промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты является сильным промотором, кроме того, он не проявляет тканеспецифичности экспрессии и активен не только в клетках крестоцветных, но и в клетках других семейств.
Использование хлоропластной и митохондриальной ДНК растений для создания челночных векторов. Геном хлоропласта состоит из кольцевых молекул ДНК длиной 120—140 кб. Внутри хлоропластов одного вида содержится до нескольких десятков таких кольцевых молекул, близких по нуклеотидной последовательности. Клетка содержит до нескольких десятков хлоропластов, и, таким образом, общее число кольцевых молекул составляет несколько сот копий на клетку. В состав кольцевых молекул входят гены рибосомальных и транспортных РНК, а также гены, продукты которых необходимы для функционирования хлоропластов.
Репликация и транскрипция хлоропластного генома осуществляется автономно. Последнее обстоятельство дает возможность использовать хлоропластную ДНК в качестве вектора. Если же «сшить» бактериальную плазмиду с фрагментом ДНК хлоропласта, содержащим участки начала репликации и участки инициации и терминации транскрипции, то можно получить челночный вектор. Такой вектор способен реплицироваться в прокариотических клетках, а в клетках эукариот не только реплицироваться, но и экспрессировать чужеродную генетическую информацию. Такие векторы будут функционировать как эписомы, т. е. автономно от хромосомы. Для конструирования челночных векторов растений могут быть также использованы кольцевые молекулы митохондриальной ДНК, длина которых варьирует в широких пределах — от 1 до 50 кб.
Кольцевые молекулы ДНК также обнаружены в ядре и цитоплазме растительных клеток. Происхождение их еще не ясно. Это могут быть амплифицированные гены или транспозоно-по-добные элементы. Эти кольцевые молекулы интенсивно изучаются и, по-видимому, могут быть использованы для создания векторов.
Методы прямого переноса генов в растение. Трансформация растительных протопластов. При обработке целлюлозной клеточной стенки растения ферментом цел-люлазой, выделенной из грибов, образуется клетка, лишенная оболочки, или протопласт. Разработаны методы прямой трансформации протопластов с помощью ДНК. Наибольшей эффективности трансформации (10 ) удалось достигнуть комбинацией методики кальциевой преципитации ДНК с методикой слия-200
ния протопластов. Хотя частота трансформации значительно ниже, чем, например, частота переноса ДНК при совместном культивировании с A. tumefaciens, метод прямого переноса обладает рядом преимуществ.
Донорная ДНК может не содержать специальных биологических сигналов и функций трансформации (пограничных областей Т-ДНК и vir-области, см. с. 196). Для трансформации может быть использован практически любой ДНК-вектор, несущий чужеродный ген. При этом гибридный ген стабильно интегрирует в ядерную ДНК растения и экспрессируется (при наличии соответствующих регуляторных областей).
Предыдущая << 1 .. 73 74 75 76 77 78 < 79 > 80 81 82 83 84 85 .. 180 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed