Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Несмотря на непрерывное совершенствование методов культивирования посевов, они всегда подвергаются экстремальным влияниям окружающей среды, таким, как засуха, воздействию высоких или низких температур, что приводит к значительным потерям продукции. Кроме того, продолжительная обработка одних и тех же площадей или посев монокультуры ведет к резким изменениям почвы. Так, например, обильно орошаемые почвы настолько сильно засоляются, что концентрация солей в них достигает токсического уровня. Поэтому использование сортов растений, толерантных к стрессовым воздействиям, имеет большое сельскохозяйственное значение.
Многие из адаптивных реакций растений на стресс включают высокоспециализированные морфологические признаки, такие, как, например, редукция листовой поверхности или уменьшение числа устьиц в условиях засухи, приводящие к задержанию растением воды. Однако такого рода морфологические признаки обусловливаются синхронным взаимодействием множества различных генов. Поэтому более доступными для ген-
но-инженерных исследований оказываются метаболистические реакции, непосредственно индуцировавшиеся фактором стресса. Так, например, известно, что в растениях, подвергающихся длительному водному стрессу, накапливаются различные органические низкомолекулярные соединения, такие, как пролин, глицинбетаин и ряд других, которые служат осморегуляторами или осмопротекторами.
Было показано сходство стрессового ответа у бактерий и высших растений: в обоих случаях в клетках происходит синтез молекул осмопротекторов, механизмом действия которых является установление осмотического балланса между цитоплазмой и окружающей средой и, кроме того, частичная стабилизация белков при стрессовых условиях. Общие метаболистические пути аккумулирования молекул осмопротекторов позволили использовать бактерии для изучения путей биосинтеза осмопротекторов и использовать гены бактериального происхождения для получения трансгенных растений, устойчивых к стрессам.
Как было сказано, накопление в бактериальных и растительных клетках свободного пролина является защитным механизмом от действия абиотического стресса. Путь биосинтеза пролина в бактериях в настоящее время хорошо изучен: превращение глутамата в пролин осуществляется тремя ферментами, кодирующиеся генами ргоА, ргоВ, ргоС. Гены были клонированы и получены векторные конструкции для трансформации на основе Ti-плазмиды, в которых гены ргоА и ргоВ были поставлены под контроль сильного конститутивного промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, который, однако, не является тканеспецифическим, и промотора Pmas, инициирующего синтез белка преимущественно в корнях, что особенно важно, так как именно корни в первую очередь подвергаются воздействию осмотического стресса. Такая избирательная экспрессия генов осмопротекторов может привести к экономии энергии растения в стрессовых условиях и, как следствие, к увеличению урожайности.
Полученные трансгенные растения осуществляли повышенный синтез и накопление пролина, превышающий в 4—6 раз синтез в контрольных растениях. Трансгенные побеги укоренялись и могли расти при концентрации соли в среде 20 г/л (350 мМ).
3.9. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К НАСЕКОМЫМ
Используя генно-инженерные методы, возможно конструирование растений с повышенной резистентностью к насекомым. Так, было показано, что бактерии Bacillus thurengiensis экс-
прессируют инсектицидный белок-прототоксии, который, попадая в кишечник насекомых, расщепляется под действием про-теаз до активного токсина, приводящего к гибели вредителей.
Препараты на основе этого токсина использовались для обработки растений в поле. Однако полученные препараты были нестойкими и довольно быстро разлагались, что не позволяло развить у вредителей устойчивость к инсектициду, в то время как продукция таких белков в растительных клетках могла обеспечивать устойчивую резистентность растений к насекомым.
Из генома В. thurengiensis был выделен ген токсина bt 2, а также его фрагменты, поставлен под контроль 35S промотора вируса мозаики цветной капусты, что позволило гену bt 2 экспрессироваться в растительных клетках и переклонироваться в бинарный вектор. Клонированный ген был интегрирован в геном растений табака с помощью Ti-векторной системы. Экспрессия бактериального гена в растительных клетках была подтверждена как на уровне транскрипции, по присутствию соответствующей мРНК, так и на уровне трансляции, по синтезу белка-токсина. Полученные трансгенные растения были устойчивы к вредителям.
Эффективность защиты сельскохозяйственных культур от вредителей была показана и на трансгенных растениях томата, трансформированных генами эндотоксина, при этом бактериальный белок, синтезированный в тканях растений, обеспечивал защитный эффект, сравнимый с использованием инсектицидных препаратов.
3.10. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ГРИБНОЙ, БАКТЕРИАЛЬНОЙ И ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
В качестве ответа на действие фитопатогенов в растениях включается целый каскад механизмов защитных реакций. При этом активный иммунитет растений может проходить по двум основным направлениям: во-первых, в ответ на инфекционную инвазию начинается синтез соединений, являющихся токсичными и ограничивающих жизнедеятельность патогенов, что в конечном итоге приводит к их гибели. Во-вторых, в качестве защитного ответа на повреждение могут создаваться структурные барьеры, которые предотвращают поступление и распространение патогенов, что достигается лигнификацией клеточных стенок растений либо укреплением клеточных стенок за счет гликопротеидов богатых гидроксипролином и других 210
