Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
интеграцию Т-ДНК, находятся не в Т-ДНК, а в области вирулентности (vir-область) (рис. 3.18).
Уникальные биологические свойства Ti-плазмиды делают его идеальным вектором, естественным агентом для переноса генов. Она имеет широкий круг хозяев, встраивает ДНК в состав хромосомы, где она реплицируется и большая ее часть транслируется с образованием белка. Существенно также, что границы Т-ДНК обозначены прямыми повторяющимися последовательностями длиной 25 нуклеотидных пар, и любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за Т-ДНК и перенесена в растительную клетку. Поскольку гены в составе К-ДНК имеют промоторы, то под их контроль можно поставить чужеродные гены. Однако из-за больших размеров манипуляции с Ti-плазмидой затруднены, вставить ген в плазмиду традиционными методами не представляется возможным.
Промежуточный и бинарный векторы. Один из способов введения чужеродной ДНК заключается в использовании промежуточного вектора. Смысл подхода состоит в следующем (рис. 3.19). Сначала Т-ДНК с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды и вставляют в вектор для клонирования в Е. coli (например, pBR 322). Плазмиду с Т-ДНК размножают и, используя стандартные методы, встраивают чужеродный ген внутрь Т-области и вновь размножают с уже вставленным геном. Затем полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefacience, несущие полную Ti-плазмиду. В результате двойного кроссинговера (гомологичной рекомбинации) между гомологичными районами Т-ДНК часть рекомбинантной плазмиды, которая содержит чужеродный ген, включится в Ti-плазмиду, заместив в ней нормальную Т-ДНК- Наконец, бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенными генами, заражают растения и в результате получают клетки корончатого галла, которые будут содержать Т-область со встроенным в нее чужеродным геном.
Другой распространенный метод введения чужеродной генетической информации заключается в использовании бинарных векторов.
Оказалось, что для заражения и трансформации растительных клеток агробактериями необходима vir-область, ответственная за перенос ДНК и прямые повторы, ограничивающие Т-район. Более того, vir-область и ДНК, содержащая на концах пограничные повторы Т-района, могут находиться в разных плазмидах. Бактерии, содержащие Ti-плазмиду с vir-областью и другую плазмиду, в которой в Т-ДНК встроены любые гены, обеспечивают интеграцию последней в геном растения. Гомологичная рекомбинация для этого не требуется.
Однако полученные клетки не будут способны к регенерации, поскольку в них подавлена дифференцировка. Если же в гены, блокирующие дифференцировку, ввести мутации или вырезать их из Т-ДНК, трансформированные клетки обретут способность к регенерации. Так, ген алкогольдигидрогеназы (АДГ) дрожжей был встроен в область клонированной Т-ДНК, ответственную за подавление дифференцировки. Этой Т-ДНК трансформировали клетки табака, из которых затем удалось регенерировать целые растения, содержащие в геноме многочисленные копии АДГ — Т-ДНК- Растения были фертильными и в клетках потомства также содержались копии химерной ДНК (рис. 3.20).
В общем случае для конструирования безвредного (для регенерации) вектора из Т-ДНК нужно удалить все ее собственные гены, оставив сигнальные прямые повторы и чужеродную
PBR322
Рис, 3.19. Использование Ti-плазмиды в качестве вектора для переноса геиов в растительные клетки
ДНК- Для того чтобы эта ДНК экспрессировалась в растительных клетках, конструируют составной ген, в котором регуляторная область с промотором взята от одного из генов Т-области (например, гена нопалинсинтетазы, ответственного за синтез нопалина), а структурная часть представлена структурной частью гена, который нужно ввести в растение. Показано, что такие составные гены, будучи интегрированными в геном растения, хорошо экспрессируются под контролем нового промотора. Таким образом, проблема экспрессии генов в трансформированных растениях в принципе решена.
Еще одно семейство плазмид А. rh.izogen.es вызывает усиленное образование корешков при заражении растений. Эти плазмиды названы Ri-плазмидами (от англ. root inducing—индуцирующий Рис. 3.20. Этапы трансформации корни). Корешки быстро растут в и получения трансгенных расте- культуре, подобно ТКаНИ КорОНЧа-нии’ того галла, причем отсутствие бак-
«тГрГГ™ СТ°абаВкСаТаВГ;Тpf„7. Терий не влияет на их рост. Выяс-
формировапиая клетка; 4 — клетки НИЛОСЬ, ЧТО КЛеТКИ КОреШКОВ ТаК-
культуры, 5 —проросток 6 —транс- же содержат опины, а их геномы формированная клетка, 7—растение г
табака содержат по нескольку КОПИИ
Т-ДНК- Ri-плазмиды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они являются естественными безвредными векторами, т. е. после трансформации растительные клетки способны регенерировать в здоровые плодовитые растения. В настоящее время эти плазмиды рассматриваются как более перспективные векторы.
Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений. Подавляющее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержат РНК- Лишь 1—2% от числа вирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содер-жащим. Именно они наиболее удобны для использования в технологии рекомбинантных ДНК и рассматриваются главными кандидатами на роль векторов для переноса генов в растения.
