Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
У свиней приживляемость эмбрионов не снижается, если двухклеточные эмбрионы извлекают из яйцевода и пересаживают в матку реципиента на той же стадии развития. Эмбрионы свиньи рекомендуется пересаживать только в один рог матки, так как они мигрируют и распределяются в обоих рогах матки. После пересадки 2—5-дневных эмбрионов приживляемость составляет 60—70%. Пересадка эмбрионов свиней на более поздних стадиях развития (7—8-дневных) сопровождается либо отсутствием беременности, либо значительным снижением при-живляемости (С. Полдж, 1982).
Хранение эмбрионов. Применение метода трансплантации эмбрионов потребовало разработки эффективных методов их хранения в период между извлечением и пересадкой. В производственных условиях эмбрионы обычно извлекают утром, а пересаживают в конце дня. Для хранения эмбрионов в течение этого времени используют фосфатный буфер с некоторыми модификациями при добавлении эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и при комнатной температуре или температуре 37° С.
Наблюдения показывают, что эмбрионы крупного рогатого скота можно культивировать in vitro до 24 ч, без заметного снижения их последующей приживляемости.
Пересадка эмбрионов свиней, культивируемых 24 ч, сопровождается нормальной приживляемостью. При этом используют простую физиологическую среду, модифицированный раствор Кребса—Рингера с добавками. Однако при пересадке эм-
брнонов свиней после 48 или 72 ч культивирования отсутствовала приживляемость (С. Полдж, 1982; Дж. П. Ринард и др., 1980).
Выживаемость эмбрионов в определенной степени может быть увеличена охлаждением их ниже температуры тела. Чувствительность эмбрионов к охлаждению зависит от вида животного.
Эмбрионы свиней особенно чувствительны к охлаждению. Пока не удалось сохранить жизнеспособность эмбрионов свиней на разных стадиях развития после охлаждения их ниже
10—15° С (С. Полдж, 1982).
Эмбрионы крупного рогатого скота на ранних стадиях развития также очень чувствительны к охлаждению до 0° С. Однако на более поздних стадиях развития, таких, как морула или бластоциста, они хорошо выдерживают охлаждение.
Эмбрионы овец хорошо переносят охлаждение до 0° С на любых стадиях развития, от одно-, двухклеточной стадии до бластоцисты. Понижение температуры хранения эмбрионов от 37° С до 10 и 0° С угнетает или останавливает их развитие, но обменные процессы протекают на уровне, обеспечивающем хранение обычно до 5—6 сут. Для длительного хранения эмбрионов необходимо не только затормозить их развитие, но и значительно снизить или полностью остановить обменные процессы. Такое состояние эмбрионов достигается при температуре —196° С или ниже.
Эксперименты последних лет позволили определить оптимальные соотношения между скоростью охлаждения и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. Установлено, что если эмбрионы охлаждают медленно (1° С/мин) до очень низкой температуры (ниже —50° С) с последующим переносом в жидкий азот, то они требуют и медленного оттаивания (25° С/мин или медленное). Быстрое оттаивание таких эмбрионов может вызвать осмотическую регидратацию и разрушение. Если эмбрионы замораживают медленно (1° С/мин) только до —25 и —40° С с последующим переносом в жидкий азот, то их можно оттаивать очень быстро (300° С/мин). В этом случае остаточная вода при переносе в жидкий азот трансформируется в стекловидное состояние (С. Вилладсен, 1980).
Выявление этих факторов привело к упрощению процедуры замораживания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. В частности, оттаивание эмбрионов, как и спермы проводят в теплой воде при 35° С в течение 20 с непосредственно перед пересадкой без применения специального оборудования с заданной скоростью повышения температуры.
В последние годы установлено, что замороженные и оттаявшие эмбрионы могут быть успешно разбавлены одноступенчато
в пайете, где они были заморожены. Сущность метода состоит в следующем. Замороженно-оттаянные эмбрионы переносят одноступенчато из раствора криопротектора, в частности 1,5 М глицерина в фосфатном буфере, в котором они были заморожены, в среду, содержащую гипертонический раствор не проникающего в клетку соединения, каким является сахароза. Это обеспечивает постепенное удаление криопротектора из эмбриона без нарушения осмотического равновесия в 0,02 мл 1,5 М глицерина.
С помощью воздушных пузырьков пайету делят на три камеры; в первой—раствор криопротектора; во второй — эмбрион в растворе криопротектора; в третьей—растворитель (1,08 М раствор сахарозы). После замораживания и оттаивания содержимое пайеты перемешивают встряхиванием. Затем эмбрион может быть пересажен из пайеты нехирургическим способом реципиенту. Этот метод позволяет пересаживать замороженно-оттаянные эмбрионы по типу искусственного осеменения. Сравнение методов одноступенчатого и многоступенчатого оттаивания эмбрионов показало, что оба они дают одинаковые результаты.
Успешное замораживание и оттаивание эмбрионов овец впервые было проведено С. Вилладсен и др. (1974). Эмбрионы медленно охлаждали (от 0,3 до 2,0° С/мин) и медленно оттаивали (от 4 до 25° С/мин). В качестве криопротектора применяли ДМСО. Позднее установлено, что при использовании 1,5 М ДМСО в фосфатном буфере замораживание со скоростью 1° С/мин до —120° С сопровождалось выживаемостью эмбрионов только в том случае, если применялось быстрое оттаивание (360° С/мин). Однако при замораживании со скоростью 0,3° С/мин была сохранена выживаемость эмбрионов как при быстром, так и при медленном оттаивании (10 или 4° С/мин). При дальнейшем уменьшении скорости замораживания до 0,1° С/мин в интервале температур между —30 и —60°С медленное оттаивание было обязательным.
