Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Индивидуальная радиоактивно меченая мРНК служит хорошим зондом для выявления бактериальных колоний, несущих искомый ген. Однако, как мы уже отмечали, индивидуальную мРНК в чистом виде удается выделить в ограниченном числе 178
случаев, как правило, в специализированных клетках, где данная мРНК синтезируется в значительных количествах. Например, в предшественниках эритроцитов больше половины всей мРНК представлено глобиновой мРНК.
В других случаях для выделения зонда прибегают к созданию банка кДНК, кодирующую данный белок, даже в условиях тысячекратного избытка других молекул мРНК, присутствующих в той же клетке.
Иногда продукт (а значит, и мРНК) искомого гена присутствует в клетке в столь мизерном количестве, что получить индивидуальную РНК не удается. Тогда можно выделить небольшое количество чистого белка и определить аминокислотную последовательность некоторой его части (обычно достаточно знания участка белковой молекулы длиной 5—6 аминокислотных остатков). По известной аминокислотной последовательности можно, установить все возможные последовательности нуклеотидов в том участке мРНК, который кодирует данную аминокислотную последовательность. Затем из отдельных радиоактивно меченых нуклеотидов химически синтезируют олигонуклеотиды длиной не менее 16 звеньев, один из которых полностью комплементарен участку искомого гена. Такие нуклеотиды и являются пробами для поисков нужных клонов к ДНК-
После того как радиоактивный зонд получен, проводят сканирование геномной библиотеки или библиотеки кДНК, которое заключается в идентификации бактериальных колоний, содержащих плазмиду с последовательностью, комплементарной зонду. На чашку Петри с бактериальными колониями накладывают лист нитроцеллюлозы; на него переходит часть бактерий с каждой колонии, тогда как другая часть остается на чашке. В результате и на чашке, и на фильтре колонии распределены одинаково. Для лизиса бактерий и денатурации ДНК нитроцеллю-лозный фильтр обрабатывают NaOH, после чего прогревают его в вакуумной печи. В результате денатурированная ДНК прочно связывается с нитроцеллюлозой. Затем целлюлозу помещают в раствор, содержащий меченую кДНК или мРНК или синтетический олигонуклеотид. В условиях гибридизации метка связывается с теми колониями, которые содержат последовательности, комплементарные зонду. Фильтр отмывают от несвязавшихся молекул и проводят радиоавтографию, которая и выявляет колонии, содержащие метку. Эти колонии идентифицируют на чашке Петри, отбирают и размножают.
Возможность выделения чистого белка позволяет осуществить и другой подход, основанный на получении антител против белка, ген которого требуется клонировать. При использовании
Белки связываются Антитела
с нитроцеллюлозой меченные 1К1
Рис. 3.13. Идентификация бактериальных колоний, содержащих плазмиду со вставкой специфической кДНК.
векторов на основе бактериофагов бактерии, зараженные фагом, содержащим искомый ген, в небольшом количестве синтезируют кодируемый им белок. Поэтому библиотеку фагов можно просмотреть, используя препарат соответствующих антител, которые связываются с белком и тем самым позволяют идентифицировать клон с нужным геном. Скриннинг библиотеки осуществляется так же, как показано на рис. 3.13, с той разницей, что вместо меченой мРНК используются меченые антитела, которые также можно идентифицировать с помощью радиоавтографии. Этот же метод используется и при клонировании ДНК в экспрессируемых векторах (см. ниже).
Блот-гибридизация. При создании клонотек генов хромосомная ДНК фрагментируется с помощью рестриктаз. При этом неизвестно, содержат ли искомый ген сайт (или сайты) расщепления данной рестриктазой. Если такие сайты присутствуют, то выделить целый ген не удастся, и нужно использовать другую рестриктазу. Однако еще предварительно, без клонирования в бактериях можно исследовать структуру индивидуальных генов, определить наличие в них тех или иных сайтов рестрикции, установить число копий данного гена в геноме. Метод блот-гибридизации, используемый для этих целей, требует наличия соответствующей мРНК или кДНК-
Анализ проводят следующим образом (рис. 3.14). Высокомолекулярную хромосомную ДНК расщепляют рест-риктазой или их набором. Образовавшиеся фрагменты разделяют по длинам электрофорезом в агарозном геле, и гель помещают на лист нитроцеллюлозы. После этого направление электрофореза меняется на перпендикулярное (в направлении листа).
При этом ДНК из геля переходит на нитроцеллюлозу и получается как бы реплика с геля.
Затем проводят гибридизацию на фильтре фрагментов хромосомной ДНК с зондом.
Зонд гибридизуется только с теми фрагментами (полосами), которые содержат соответствующий ему ген. Полосы, с которыми связывалась метка, выявляют радиоавтографией.
Наличие на автографе одной полосы свидетельствует о том, что при реакции рестрикции ген не расщепляется, а интенсивность полосы дает возможность определить число копий гена в геноме. Таким образом, описанный метод может оказаться очень полезным для анализа гена или семейства генов с целью выбора оптимальной стратегии клонирования.
