Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Стало ясно, что можно проводить дальнейшие эксперименты, в
которых эти плазмиды будут встраиваться в самые разнообразные чужеродные ДНК, происходящие как из микробов, так 170
Отбор клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, ло способности расти в присутствии антибиотика
*
и из тканей высших растений и животных. Хромосома Е. coli содержит, например, около 500 сайтов для Eco RI. За счет случайного встраивания Eco RI фрагментов в векторную молекулу можно клонировать все гены Е. coli в виде фрагментов. Эти фрагменты легко выделить, обработав выделенные клоны гибридных плазмид той же рестриктазой и разделив плазмиду и хромосомные фрагменты с помощью электрофореза. Затем их легко извлечь из геля и использовать для генетических и биохимических исследований.
В зависимости от задач исследователей векторы условно можно разделить на два класса: 1) обычные векторы клонирования, при помощи которых из набора генов выделяют гены, размножающиеся в достаточных количествах для последующего изучения; 2) специализированные векторы для получения клонотек генов и для экспрессии генов.
Из класса обычных векторов, как мы уже говорили, в начальный период развития генетической инженерии наиболее широко использовали плазмиды hSC 101 и Col ЕI, выделенные из Е. coli. Большинство последующих плазмид конструировали на основе Coi El, которая отличается способностью к накоплению значительных количеств плазмидной ДНК.
Плазмидные векторы в присутствии хлорамфеникола могут умножаться независимо от деления хромосомы, и число копий плазмиды может многократно увеличиваться, достигая (10—20)’ 10" копий на клетку. Использование векторов общего назначения методически не сложно, так как не требует специального оборудования, и в связи с этим они получили широкое распространение во многих лабораториях мира. Одна из наиболее часто употребимых плазмид для клонирования HBR 322 создана на основе плазмид природного происхождения, выделенных из Е. coli (рис. 3.8). Эта плазмида содержит гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину и тетрациклину, причем в генах устойчивости к этим антибиотикам имеются сайты рестрикции. Если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику. Но при этом сохраняется устойчивость к другому антибиотику. Таким образом вектор дает возможность детектировать только те клоны бактерий, которые содержат рекомбинантную плазмиду.
Создание рекомбинантных молекул дало возможность анализа ДНК растений и животных. Теперь путем случайного
Г T„.« 1
Гетеропогичная “ ДНК
Плазмида рвязгг встраивания множества
рестрикционных фрагментов ДНК в подходящие бактериальные плазмиды (эта процедура была названа «методом дробовика») можно с большой вероятностью получить клон, содержащий интересующий нас ген или какую-либо регуляторную последовательность. При этом нужно уметь из множества клонов отобрать интересующий исследователя.
Библиотека генов. Фаговые векторы. Косм иды.
«Метод дробовика» дает возможность получать библиотеки (или клоноте-ки) генов с целью выделения хромосомных генов. Оказалось, что гены эукариот занимают достаточно протяженные участки ДНК (до 10 тыс. нуклеотидных пар и более). Кроме того, для изучения регуляторных последовательностей, находящихся за пределами кодирующей части генов, необходимо клонировать еще более протяженные области генома. Оказалось, что для клонирования таких фрагментов плазмидные векторы не подходят. Дело в том, что плазмиды, содержащие большие вставки хромосомной ДНК, нестабильны и при репликации постепенно уменьшаются в размере в результате делеции все большего числа нуклеотидов чужеродной ДНК- Значит, при создании библиотеки емкость вектора играет существенную роль.
На основе бактериофага были сконструированы векторы, в составе которых фрагменты ДНК длиной до 20 тыс. н. п. весьма стабильны, т. е. их емкость достигает 20 килобаз (1 килобаз — 1000 нуклеотидных пар). При создании таких векторов учитывалось то обстоятельство, что вся центральная часть молекулы ДНК фага не нужна для репликации в Е. coli. Эту область с помощью рестриктазы вырезают из генома фага так, что правый и левый концевые фрагменты, необходимые для репликации, ос-172
Устойчивость только к Tet
Устойчивость только к Amp
Рис. 3.8. Клонирование в векторе pBR 322:
/ — линейная плазмида; 2 — гетерологичная ДНК
Рис. 3.9. Клонирование ДНК в векторе на основе бактериофага к:
/ — участок, ие нужный для репликации Я.-ДНК 2 — фрагменты содержат всю информацию для репликации в Е. соН, но хромосома мала для упаковки
таются интактными. Концевые фрагменты отделяют от остальных фрагментов и используют для получения новых—подобных фагов, содержащих на месте вырезанной фаговой ДНК вставку чужеродной ДНК размером около 15 кб.
