Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и обеспечивающие ее репликацию, а может быть, и экспрессию, называются векторными молекулами. Таким образом, векторы позволяют осуществить введение в клетку дополнительной генетической информации. В качестве векторов используют, как правило, плазмиды, бактериофаги, мобильные элементы, вирусы животных. Первые плазмиды-векторы были выделены из бактерий; в последующем большинство векторов было сконструировано при помощи методов генетической инженерии в соответствии с задачами экспериментаторов.
К векторной молекуле предъявляются следующие основные Требования:
1) она должна иметь область, чувствительную к определенной эндонуклеазе рестрикции, которая расщепляет вектор, как правило, в одном участке, превращая его кольцевую форму в линейную. К линейной ДНК «пришивают» ген или гены и затем снова замыкают ее в кольцо и рекомбинантную ДНК вводят в клетки;
2) вектор должен реплицироваться в определенных клетках. Репликация осуществляется посредством специфического уча-168
стка ДНК-репликатора, где сосредоточен реплицирующий аппарат клетки и начинается репликация;
3) в составе векторной молекулы должен быть маркерный ген, который после проникновения вектора в клетку придает ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора. Иными словами, вектор должен иметь селективный генетический признак. Часто в качестве селективных используют широко распространенные в природе гены ферментов, модифицирующих антибиотики и инактивирующие их действие. Например, в присутствии гена Р-лактамазы бактериальная клетка приобретает устойчивость к пенициллину и на среде с этим антибиотиком образует клон или колонию клеток, несущих данный ген, обычные клетки на данной среде погибают. Значит, если вектор содержит ген Р-лактамазы, то при помощи среды с антибиотиком легко обнаруживаются клетки, содержащие его, т. е. «трансформированные вектором».
Бактериальные плазмиды в качестве векторов для клонирования. Основная масса клеточной ДНК бактерий содержится в хромосоме (в хромосоме Е. coli, например, 4 млн. пар нуклеотидов). Однако кроме хромосом бактерии содержат большое число очень маленьких кольцевых молекул ДНК длиной несколько тысяч пар оснований. Такие минихромосомы называют плазмидами. Как правило, плазмиды имеют в своем составе гены устойчивости к антибиотикам. Эти гены находятся в плазмидах, а не в главной хромосоме, поскольку в этом случае они представлены гораздо большим числом копий. Высокая копий-ность плазмид обеспечивает клетке синтез большого количества ферментов, химически нейтрализующих антибиотики, что и обеспечивает устойчивость к последним.
Некоторые плазмиды, называемые эписомами, могут интегрировать в главную хромосому и передаваться от одной бактерии к другой при конъюгации, когда копия «мужской» хромосомы переходит в «женскую» клетку. Такие плазмиды называются трансмиссибельными, и они легко передают свои гены. Поскольку плазмидная ДНК значительно меньше хромосомной, ее довольно легко выделить в чистом виде. В присутствии ионов Са плазмиды легко поглощаются бактериями, которые их не содержали, и в клетках бактериального потомства можно обнаружить много копий поглощенной плазмиды. Однако бактериальная клетка обычно может содержать в своем составе плазмиды одного типа.
Число копий плазмиды в клетке может существенно варьировать. Это зависит от генетических особенностей как клетки,
Соединение^
Плазмида
pSC101
так и плазмиды. Плазмиды,
находящиеся «под ослабленным контролем», могут размножаться до тех пор, пока их число не достигнет 10—200 копий на клетку. Если же плазмида находится «под строгим контролем», она реплицируется с той же скоростью, что и главная хромосома. Такие плазмиды содержатся в клетке в одной или в нескольких копиях. Естественно, что для клонирования рекомбинантных ДНК стараются использовать плазмиды первого типа.
В качестве вектора впервые плазмида была использована в 1973 г. Эксперименты проводились с ма-
ленькой плазмидой Е. coli pSC 101, поскольку она содержит только один сайт расщепления Eco R1 (рис. 3.7). Под действием фермента плазмида превращалась в линейную молекулу с лип-Рис. 3.7. Схема эксперимента по клониро- кими концами. Такую плаз-ванию фрагментов ДНК с помощью плаз- мидную ДН{< смешивали в
/ — встраиваемая гетерологичная ДНК; ОПТИМЗЛЬНЫХ КОНЦеНТр ЗЦИЯХ 2— маркер устойчивости к антибиотику; И ОТНОШеНИЯХ С фраГМеНТа-3 — рекомбинантная молекула ДНК; 4— вве- м и „ иЖРГ,п п нпй ЛНК тяижр дение в бактериальные клетки М“ ЧуЖерОДНОИ ДП1Ч, ТаКЖв
обработанной hco RI и
имеющей такие же липкие концы. Фрагменты сшивали ферментом ДНК-лигазой из фага Т4. В результате получились новые гибридные плазмиды, содержащие в своем составе фрагменты чужеродной ДНК- Затем бактериальные клетки трансформировали гибридными плазмидами и по способности расти в присутствии антибиотика отбирали клоны, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК.
