Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Мы уже говорили, что определенные фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием ферментов рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК-
Сшивка по одноименным «липким» концам. Некоторые рестриктазы, например Eco RI, вносят в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания. Эти комплементарные Друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплементарными или липкими концами.
Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы, образуемые Eco RI, не будут спариваться, например, с АГЦТ-концами, образуемыми HindIII. Но любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитиевыми участками комплементарных нуклеотидов (рис. 3.4).
Однако после такого спаривания целостность двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для их восстановления, т. е. сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию-сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации. Таким образом, лигаза завершает образование рекомбинантной ДНК- Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 г. (Берг, США), и было показано, что использование рестриктазы, дающей «липкие» концы, в сочетании с ДНК-ли-газой может послужить основой для создания общего метода рекомбинации.
Сшивка по «тупым» концам. Липкие концы абсолютно необходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам.
Однако липкие концы можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого используют фермент — концевую трансферазу из тимуса теленка, которая присоединяет нуклеотиды к З’-концам цепей ДНК (рис. 3.5). Так, например, если к обоим З’-концам двуцепочечного фрагмента присоединить поли-дА, а к З’-концам другого фрагмента — поли-дТ, то при смешивании этих двух фрагментов между комплементарными одноцепочечными концами происходит спаривание. Для ковалентного соединения двух фрагментов используют ДНК-лигазу. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.
При таком способе соединения между фрагментами встраи-А А А АА
ваются участки-------. Такие дополнительные последовательно-
сти могут влиять на функции соединяемых молекул, и поэтому всегда, когда только возможно, для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия рестриктаз.
зч
?3' ? 5'
Концевая
трансфераза
S'l
3'«
AA(An)AA-Ojj
?3'
HO-TT(T)nT7t
35'
ДНК-пигаза
ковалентно
соединяет
фрагменты
5*1
31
АА(А)„АА с ТТ(Т)ПТТ с
?з'
35'
lACCjGGTi
TGGCCA
Нрв
!¦
Рис. 3.5. Сшивание фрагментов ДНК с «тупыми» концами
Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами.
В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, т. е. некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или «переходники»). Линкеры — это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию (рис. 3.6). Существуют большие наборы таких генных «переходников». Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры не только обеспечивают объединение генов, но и
ICGGT | СА
f^pCGAATT $
AflCGAATTlCGGT
TGGClTTAAGClCA
*i/
EcoR I
Рис. 3.6. Использование переходника для соединения фрагментов с «разноименными» липкими концами
обусловливают их экспрессию. Существуют линкеры «тупой конец— липкий конец».
При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента — эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы «застраивают», т. е. с помощью ДНК-полимеразы I на однонитиевых липких концах синтезируют вторую нить.
После того как ДНК сшита в пробирке, ее надо ввести в живые клетки, и тут возникает проблема вектора.
Векторные молекулы. Трансформация. Ключевой операцией в генетической инженерии является введение в клетку и стабильное поддержание генетической информации, содержащейся в рекомбинантных молекулах ДНК- Это достигается при помощи так называемых векторных молекул или векторов. Дело в том, что при обычном введении ДНК, например, в бактериальную клетку она, как правило, подвергается атаке ферментов, которые разлагают ее на составные компоненты — нуклеотиды. В некоторых случаях ДНК «выживает» в клетке, однако в процессе деления клеток она не наследуется и теряется. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном (интегрироваться в хромосому) и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации.
