Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Для созревания фаговой частицы ее хромосома должна иметь длину около 45 кб. Это обстоятельство оказалось весьма удобным при отборе рекомбинантных фагов. Размножаются только те фаги, которые содержат оба конца фаговой хромосомы и вставку чужеродной ДНК подходящей длины (15—20 кб) (рис. 3.9). Фрагменты чужеродной ДНК получают ферментиро-ванием высокополимерной хромосомной ДНК при помощи ре-стриктаз. Рестриктазу и режим обработки ДНК подбирают таким образом, чтобы размер полученных фрагментов приблизительно соответствовал емкости вектора. Полный гаплоидный набор хромосом клетки млекопитающего содержит около 3* 109 пар оснований. При емкости вектора 15 кб проверка миллиона фаговых бляшек позволяет проверить весь геном на присутствие данного гена. Но для этого нужно иметь соответствующий «зонд» (см. далее).
Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—40 кб). Такой емкостью обладают плазмиды-косми-ды, содержащие cos-участок генома фага, участвующий в упа-
ковке ДНК в фаговую частицу на конечной стадии развития. Как оказалось, для упаковки ДНК необходимо, чтобы ДНК содержала cos-участок и размер ее должен быть примерно равным размеру генома фага (около 45 кб). Следовательно, к кос-миде можно пришить клонируемую ДНК значительных размеров (30—40 кб). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться, как фаги. Ими с весьма высокой эффективностью трансформируют клетки Е. coli. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную cos-сайтами, размножается в Е. coli как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта. Использование космид позволяет получать клонетки практически любых организмов, ограничиваясь не более 2—5*10э клонами. Геномные библиотеки используют для выделения генов.
3.3. ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОВ
Выделение генов — один из главных этапов в генетической инженерии. Успех на этой стадии создания рекомбинантных ДНК зависит прежде всего от следующих факторов: насколько изучен данный ген и его положение в геноме донора; от разработки методов выделения мРНК данного гена и методов обнаружения функциональной активности продукта данного гена; существования объектов, в которых данный ген находится в больших количествах (амплифицирован) или в которых он особенно активен, что позволяет выделить достаточные количества его мРНК, которые можно использовать для получения ДНК этого гена путем обратной транскрипции. В принципе существуют два основных пути получения гена: либо ген синтезируют, либо из клонотеки отбирают ту рекомбинантную ДНК, которая содержит нужный ген.
Синтез комплементарной ДНК (кДНК). Осуществление первого пути стало возможным вследствие открытия фермента—обратной транскриптазы, или ревертазы. Этот фермент был выделен из некоторых РНК-содержащих онкогенных вирусов. Фермент осуществляет РНК-направляемый синтез ДНК, т. е. на молекуле РНК, как на матрице, синтезируется комплементарная цепь ДНК- Отсюда и название фермента — он катализирует реакцию, обратную первому этапу экспрессии гена — транскрипции.
Предположим, что нам удалось выделить гомогенный препарат мРНК, специфичной для определенного гена. В некото-174
рых случаях, когда эта мРНК составляет существенную часть тотальной мРНК, это удается. Эукариотические мРНК, как правило, содержат на своем З’-конце последовательность, состоящую из остатков адени-на — поли (А) последовательность. Для начала реакции ферменту нужна затравка в виде неболь-
5'
мРНКС
"Хвост" ро!у(А)
_________3 V—
]АААААААА
ТТТТ
Вирусная обратная транскриптаза
Затравка oligo (dT)
АААААААА
ТПТ
Шпилька
ТТТТ
ДНК-попимераза
ной ДНК. Если смешать короткие олигонуклеотиды, состоящие из остатка тимина (олиго-дТ), они будут гибридизоваться с поли(А) последовательностью, и такой дуплекс
шого отрезка двуцепочеч-
Нуклеаза S1 (специфически расщепляет одноцепочечные полинуклеотиды)
' Двуцепочечная кДНК
будет служить затравкой Рис. З.Ю. Синтез двуцепочечной кДНК на для начала ферментатив- мРНК ной реакции. В результате образуется гибридная РНК—ДНК-молекула, причем на конце у нее будет короткий отрезок двуцепочечной ДНК — шпилька. Она может служить затравкой для синтеза второй цепи ДНК, который осуществляет фермент ДНК-полимераза I (рис. З.Ю). С помощью эндонуклеазы SI, которая специфически гидролизует одноцепочечные участки ДНК, шпильку можно расщепить. В результате получится двуцепочечная молекула ДНК с одной из нитей комплементарной мРНК. Такую ДНК. называют кДНК, и она соответствует структурному гену, с которого транскрибировалась исходная молекула мРНК.
К полученной кДНК пристраивают липкие концы (см. рис. 3.4) и встраивают в плазмиду, например pBR322. Рекомбинантную ДНК вводят в Е. coli, где кДНК размножается. Подобная схема была использована для получения генов, кодирующих инсулин, гормон роста, интерферон, глобин, альбумин, иммуноглобулины и ряд других белков, производство которых уже налажено микробиологической промышленностью.
