Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Для того чтобы убедиться, что получен именно тот ген, который требовался, существует несколько приемов. Если известна последовательность аминокислот белка, кодируемого геном, то,
ч Рекомбинантная \ плазмида
Денатурация
Чистая мРНК
I
аое
I
Рис. 3.11. Идентификация плазмид, содержащих в виде вставок специфические кДНК с помощью ДНК — РНК-гибридизации на фильтрах
определив нуклеотидную последовательность клонированной ДНК одним из методов секвенирования (см. рис. 3.3), можно убедиться, что она кодирует именно этот белок. Иногда применяют метод ДНК — РНК, гибридизации. Это возможно в том случае, если выделена индивидуальная мРНК (рис. 3.11). Молекулы кДНК подвергают денатурации (при этом нити ДНК расходятся) и смешивают с избытком мРНК. В условиях ренатура-ции (это процесс, обратный денатурации, при котором происходит восстановление двойной спирали, причем последняя может образоваться как из двух цепей ДНК, так и из цепи ДНК и комплементарной ей цепи РНК) будет происходить образование
гибридных ДНК—РНК-молекул. С помощью эндонуклеазы SI можно убедиться в их полной комплементарности, а значит, и в том, что получен именно тот ген. Если ДНК не полностью комплементарна РНК, то в гибридной молекуле будут одноцепочечные неспаренные участки, которые будут гидролизованы эндонуклеазой SI. Более простой вариант этого метода состоит в том, что в реакции гибридизации участвует суммарная, а не индивидуальная мРНК- В результате гибридизации с кДНК индивидуальная мРНК окажется в составе гибридных молекул. Тогда эта мРНК не сможет направлять синтез полипептидов в бесклеточной белоксинтезирующей системе, и по отсутствию сопутствующей белковой полосы после разделения электрофорезом можно убедиться в соответствии гена мРНК.
Если кДНК в составе векторной молекулы способна к экспрессии, т. е. на ней синтезируется мРНК, а затем белок, то ген можно идентифицировать по его продукту с помощью специфического иммунохимического метода обнаружения белка. Таким образом, используя один из этих методов или их комбинацию, можно убедительно доказать, что получен именно нужный ген.
Мы рассмотрели случай, когда удалось выделить индивидуальную мРНК. Это возможно, если ген избирательно активен в определенных клетках и тканях. В этом случае реакцию обратной транскрипции проводят со смешанной популяцией мРНК и в результате получают кДНК, представляющую смесь обратных транскриптов со всех типов мРНК.
Создание банка кДНК. Теперь задача сводится к выбору из популяции молекул кДНК тех обратных транскриптов, которые представляют искомый ген. Чаще всего в этом случае прибегают к методу создания банка кДНК. Для этого с помощью линкеров молекулы кДНК сшивают с векторными молекулами и трансформируют ими бактериальные клетки. Причем опыт строится таким образом, что каждая бактериальная клетка получает только одну рекомбинантную плазмиду. В результате каждая бактериальная колония будет содержать только один вид кДНК- Далее отбирают единичные колонии и выращивают из них большие гомогенные культуры. Из клеток выделяют плазмиды, имеющие вид вставок кДНК. Плазмидную ДНК денатурируют (при этом нити ДНК расходятся), и денатурированную ДНК необратимо связывают (иммобилизуют) с нитро-целлюлозными фильтрами. Через фильтр пропускают исходную смесь мРНК, и те молекулы мРНК, которые комплементарны данной кДНК, в результате ренатурации связываются с фильт-
Tet -колонии, содержащие химерные ппазмиды
Чистая ДНК
32
меченная Р
Плазмидная ДНК связана с фильтром
Радиоавтография
Поаучение реплики на нитроцеллюлозном фипьтре
Рис. 3.12. Идентификация плазмид, содержащих в виде вставок специфически? кДНК с помощью ДНК — РНК-гибридизации иа фильтрах
ром. Таким образом, из смеси молекул мРНК можно выделить любую их фракцию (рис. 3.12).
Связавшуюся с фильтром мРНК можно элюировать (смыть) с фильтра и добавить к бесклеточной системе трансляции. Если при этом будет синтезироваться нужный белок, значит, данный бактериальный клон содержит в своих плазмидах искомый ген. Следует отметить, что чем представительней в популяции молекул мРНК транскрипты с искомого гена, тем легче его выделить описанным выше методом.
Другой прием — иммунный скрининг колоний, т. е. поиски клона, который синтезирует нужный белок с помощью радиоактивных антител к нему. Этот метод осуществим в том случае, когда ген экспрессируется в составе рекомбинантной плазмиды.
Выбор нужного гена из клонотеки — второй из наиболее распространенных способов получения гена. В этом случае задача исследователя сводится к поиску среди миллионов бактерий тех, которые содержат фрагмент ДНК с интересующим его геном. В настоящее время для решения такой задачи применяются молекулярные зонды (пробы). Зонд представляет собой меченую молекулу нуклеиновой кислоты или белка, имеющую сродство к самому гену или его продукту, соответственно.
