Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка):
Вначале мы выделили участок ДНК, содержащий оба промотора, и присоединили к одному из его концов ген lacZ, лишенный собственного промотора. Продукт гена lac Z, (3-га-лактозидаза, можно было легко обнаружить. В одном штамме транскрипция lacZ начиналась с промотора PRM (рис. 4.19,А), а в другом-с промотора PR (рис. 4.19,Б). Исходная конструкция содержала оператор 0R дикого типа, в других случаях присутствовали только один или два функциональных участка
108
!ас- репрессор
lac г
=>
-8—S-
I РцОц lac г
|Выи.|
Рис. 4.19. Бактериальные штаммы, сконструированные для анализа действия изолированных операторных участков. Оба типа клеток содержат плазмиду, обеспечивающую синтез Х-репрессора под контролем /аорепрессора. Кроме того, клетки А содержат конструкцию PRM-lacZ, а клетки Б PR-lacZ. Чем больше ИПТГ добавлено в среду, тем больше Х-репрессора образуется. Уровень р-галактозидазы в клетках обоих типов, растущих при различных концентрациях ИПТГ, показывает, как каждый из промоторов отвечает на различные концентрации Х-репрессора. Ор обозначает /ас-оператор, который вместе с /ас-промотором был встроен перед геном с/
связывания репрессора, а активность других участков была подавлена с помощью мутаций.
Клетки обоих типов, представленные на рис. 4.19,А и Б, содержали 1акже в составе плазмиды ген, кодирующий л-ре-прессор, причем концентрацию репрессора можно было варьировать. Плазмида несла ген с/, транскрибируемый с промотора lac (Plac), и ген /ас-репрессора lacl, продукт которого выключает /ас-промотор. Количество ^.-репрессора, синтез которого детерминируется этой плазмидой, можно регулировать, добавляя ИПТГ. Данное соединение инактивирует lac-репрессор, в результат чего снимается репрессия /ас-промотора и синтез ^.-репрессора увеличивается.
В обычных условиях репрессор и белок Сго, которые начинают синтезироваться с промоторов PRM и PR соответственно, влияют на активность промотора по механизму обратной связи. Однако в наших экспериментах (3-галактозидаза не оказывала влияния ни на один из промоторов, устраняя тем самым сложности, связанные с регуляцией по механизму обратной связи. Таким образом, этот подход позволяет выяснить, как действует связывание репрессора с различными участками в составе 0R на промоторы PR и PRM.
Из рис. 4.20 видно, что при низких концентрациях А.-ре-прессора активность промотора PRM повышается, а при высоких падает. Далее, по мере того как репрессор включает транскрипцию с PRM, он координированно выключает транскрипцию с PR, причем подавление активности PR в два раза от максимального значения происходит при такой концентрации репрессора, когда PRM наполовину активирован. Максимальная активация PRM наблюдается при такой концентрации репрессора, какая обнаруживается в лизогенных клетках. При этом активность PR подавлена более чем на 99%.
В каком порядке должны заполняться участки 0R, чтобы вначале произошло включение PRM и выключение PR, а затем выключение PRM? Для ответа на этот вопрос были проведены эксперименты, подобные представленным на рис. 4.20, но теперь ^.-операторы несли мутации в двух операторных участках каждый. Эти мутации подавляли связывание репрессора с поврежденными участками, но промоторы оставались неповрежденными. Это позволило изучить эффект связывания репрессора только с одним из участков. Результаты можно суммировать следующим образом.
• Or2"Or3_. Репрессор, связанный с 0R1, выключает PR, но не активирует РRM (рис. 4.21 ,А).
• 0r1~0r2 . Репрессор, связанный с 0R3, не может ни активировать PRM, ни подавлять PR (рис. 4.21,5).
• 0R1 ”0R3”. Репрессор, связанный с 0R2, активирует РRM и подавляет PR (рис. 4.21,5).
В табл. 4.2 суммированы данные об активности промото-
110
3 2 1 3 2 1 3 2 1
Концентрация репрессора-------»-
Рис 4 20 Регуляторное действие репрессора in vivo На этом графике сум мированы результаты опытов с клетками двух типов, изображенными на рис 4 19 В обоих случаях измеряли количество (} галактозидазы образую шейся при разной концентрации ИПТГ Середины кривых репрессии и активации приходятся на одну и ту же концентрацию ИПТГ т е соответствуют одной и той же концентрации репрессора Концентрация репрессора, необходимая для максимальной активации Лш > примерно соответствует уровню который обнаруживается в лизогене Прямоугольники в нижней части рисунка \ с товно изображают состояние каждого операторного участка при различных концентрациях репрессора Темные прямоугольники соответствуют занятым
участкам
ров PR и Рш в случае, когда репрессор связывается с одним операторным участком
Внимательное рассмотрение кривых на рис 4 21 позволяет \ видеть результат кооперативного связывания репрессора с соседними участками Например, хотя связывание репрессора только с 0R2 активирует PRM и подавляет PR, для такой акшвации и репрессии в случае мутантных 0R1 и 0R3 требуется больше репрессора Объясняется это тем, что мутация \сграняет вспомогательный кооперативный эффект репрес-сору приходится связываться с Ок2 без «поддержки» со стороны репрессора, связанного с 0R1
