Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка):
124
Оощий фосфат Области контакта / Области контакта
0R3 —I I-----0„2----1 Н-OrI-H
рй
Рис. 4.27. Расположение А.-репрессора на операторных участках 0„1 и 0R2 и полимеразы на PRM. Боковая поверхность двойной спирали ДНК изображена в виде плоскости, чтобы показать все фосфаты, контактирующие с полимеразой в области Ркм и с репрессором в области 0„1 и 0R2. (Футпринтинг при участии ДНКазы показывает, что полимераза занимает более протяженный участок ДНК, чем можно судить по контактам с этими фосфатами. Мы всюду изображаем полимеразу с учетом этого факта.)
Рис. 4.28. Мутации фага Хрс. Три аминокислоты, которые замещают соответствующие остатки в белке дикого типа, в трех мутантах Хрс обведены кружками. Остатки, заключенные в ромбики, сохраняются в составе би-спиральных элементов многих специфических ДНК-связывающих белков. Обратите внимание, что рс-мутации не затрагивают ни консервативные остатки, ни остатки узнающей спирали.
рый, если судить по положению общего с полимеразой фосфата, обращен к полимеразе (см. рис. 2.17).
Как видно из рис. 4.28, мутации Хрс приводят к изменению узнающего ДНК биспирального элемента белка и затрагивают остатки одной из спиралей и области поворота, но не изменяют остатки узнающей спирали. На этом основании с учетом некоторых дополнительных соображений можно вы-
125
Рис 4 29 Связывание репрессора Р22 с участками 0R1 и 0„2 и полимеразы с Лш Сравните этот рисунок, на котором показаны фосфаты 0R и PRU фага Р22, контактирующие с белками, с рис. 4.27.
0р>2
Общий
фосфат
Мутации, нарушающие 'позитивную т регуляцию
Мутации,
нарушающие
позитивную
регуляцию
Р 22
Рис 4 30 Положение «общего фосфата», контактирующего с полимеразой и репрессором, относительно биспиральных элементов репрессоров фагов X и Р22. Как и можно было ожидать исходя из различия в расположении этих репрессоров относительно полимеразы, связанной с PRM, рс-мутации у репрессоров фагов X и Р22 локализованы на разных поверхностях.
сказать предположение относительно механизма взаимодействия репрессора Р22 с полимеразой.
На рис. 4.29 показано, как располагаются репрессор Р22 на участках 0R 1 и 0R 2 и полимераза на Рш. Данные получены путем идентификации фосфатов, контактирующих с белками. Обратите внимание, что Х-репрессор и полимераза расположены вдоль ДНК друг за другом, как вагоны поезда, а репрессор Р22 и соответствующая полимераза лежат на ДНК рядом друг с другом, образуя подобие бутерброда (не забудьте, что на рисунке показана плоская развертка цилиндрической поверхности двойной спирали). Обратите также внимание, что имеется единственный «общий» фосфат, с которым контактируют и репрессор Р22, и полимераза.
Если судить только по тому набору фосфатов, с которыми контактирует полимераза, «общий» фосфат располагается в промоторе Р22 так же, как и в промоторе Рш фага X. Что же касается репрессора, относительно него «общий» фосфат располагается по-иному, чем в случае фага X. Хотя нам неизвестна структура репрессора Р22, мы все-таки знаем, какой участок его аминокислотной последовательности образует предполагаемый ДНК-узнающий биспиральный элемент. Из рис. 4.30 видно, что если репрессор Р22 касается полимеразы какой-либо частью биспирального элемента вблизи «общего» фосфата, то в этом должны участвовать остатки С-концевой части узнающей спирали. Эта ситуация совершенно отлична от случая с А.-репрессором, который изображен на том же рисунке и в котором остатки, затронутые мутациями рс, располагаются вблизи N-конца узнающей спирали.
Некоторые /эе-мутации репрессора Р22 затрагивают сам С-конец узнающей спирали, а другие (если исходить из соображений о структурной гомологии белков) - участок поблизости от С-конца. Отсюда следует, что оба белка, осуществляющих позитивную регуляцию, должны связываться с одной и той же поверхностью РНК-полимеразы, но участвуют в этом разные поверхности репрессоров (рис. 4.30). По всей вероятности, существенно, что все пять выделенных к настоящему времени /х'-мутаций у репрессоров X и Р22 состоят в замене аминокислоты в белке дикого типа на более основную аминокислоту (при этом увеличивается положительный заряд).
Исследования очищенных репрессоров, содержащих рс-мутации, показали, что они нормально или близко к этому связываются с ДНК, подавляют PR, но неспособны активировать PRM.
Позитивная регуляция in vitro 143]
Репрессор увеличивает эффективность транскрипции с PRM примерно в 10 раз. Этот эффект легко наблюдать, только если
127
концентрация полимеразы не превышает определенного уровня; при высокой концентрации полимеразы РRM эффективно работает как в присутствии, так и в отсутствие репрессора. Именно этого следует ожидать, если роль репрессора заключается в увеличении частоты взаимодействия полимеразы с РRM.
По данным футпринтинга максимальная активация РRM под действием репрессора наблюдается при такой его концентрации, когда он заполняет только участки 0R 1 и Ок2. При более высокой концентрации заполняется также Ок 3. и РRM подавляется. Если промотор содержит мутантные 0R 1 и 0R 2 или если мутантен только 0R 2, никакой стимуляции PRM под действием репрессора не наблюдается. Если мутантны 0R 1 и 0R 3, стимуляция РRM возможна, но она происходит при более высокой концентрации репрессора, чем в случае интактного участка 0R 1. Напомним, что, если 0R 1 несет мутацию, 0R 2 слабее связывает репрессор. Выделенный N-концевой домен репрессора также стимулирует PRM и in vivo, и in vitro; в этом случае эффект не зависит от того, несет ли 0R 1 мутацию. Напомним, что N-концевой домен связывается некооперативно.
