Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Пташне М. -> "Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг" -> 34

Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.

Пташне М. Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг — М.: Мир, 1989. — 160 c.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка): pereklucheniegenov1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 28 29 30 31 32 33 < 34 > 35 36 37 38 39 40 .. 56 >> Следующая

103
В месте метилирования чувствительность ДНК к химическому расщеплению резко увеличивается. В результате расщепления молекул по метилированным участкам после электрофореза образуется «лесенка», каждая ступенька которой соответствует расщеплению по метилированным звеньям А или G. Репрессор, связавшись с ДНК, может защитить соответствующие основания от метилирования; это позволяет обнаружить пары оснований, которые расположены ближе всего к связанному белку. Иногда в присутствии белка по непонятным причинам увеличивается скорость метилирования определенных участков; такое же явление наблюдается и при ДНКазном расщеплении.
В экспериментах по ДНКазному футпринтингу репрессор защищает участок оператора длиной 17 пар оснований плюс еще по нескольку пар оснований с обеих сторон. Как видно из рис. 4.16, он защищает от метилирования под действием ДМС и звенья G в пределах оператора, но не вне его. На метилирование А репрессор не влияет, и это согласуется с представлением о гом, что он располагается в большом, а не в малом желобке оператора.
Итак, отметим главное: изолированные N-концевые домены ведут себя подобно интактным димерам, за исключением того, что для защиты от расщепления необходима более высокая их концентрация. Таким образом, единственный вклад С-концевого домена в связывание димера с операторным участком состоит в том, что он увеличивает силу связывания, удерживая вместе два N-концевых домена. Имеются данные, что и в клетке N-концевые домены в отсутствие С-концевых связываются с оператором: штамм Е. coli, в котором образуется большое количество дефектного репрессора, включающего только остатки 1 -92, устойчив к суперинфекции фагом X.
Правый оператор состоит из трех участков связывания репрессора длиной 17 пар оснований каждый.
Репрессор и белок Сго связываются с одной и той же стороны двойной спирали в каждом участке связывания (рис. 1.16 и 1.22).
При анализе 0К обнаруживаются три сходные последовательности длиной по 17 пар оснований. Каждая из них обладает несовершенной вращательной симметрией второго порядка. Левый оператор 0Ь также состоит из трех сходных участков (табл. 2.1).
104
Химическое зондирование [29, 30, 31, 32, 61]
Как показывают данные по связыванию с фильтрами и результаты футпринтинга, и репрессор, и Сго могут связываться с каждым из этих участков по отдельности. Оба белка защищают от метилирования звенья G, лежащие с одной стороны двойной спирали каждого из участков связывания (см. левую час1ь рис. 4.16). Кроме того, репрессор в отличие от Сго защищает один из двух звеньев G, лежащих с задней стороны двойной спирали примерно посередине каждого участка связывания. Ниже мы покажем, что в этих взаимодействиях с задней стороны спирали участвуют гибкие «руки» Х-репрессора.
Для идентификации тех фосфатных групп ДНК, которые контактируют со связанным белком, можно использовать химический агент этилнитрозомочевину. На рис. 4.16 отмечены фосфатные группы операторного участка 0R1, с которыми контактирует репрессор. Они лежат по одну сторону двойной спирали. Некоторые из этих групп контактируют с белком Сго, в том числе шесть «внутренних» фосфатов, но не четыре «внешних» (считая от середины операторного участка к его краям). Как в случае репрессора, так и в случае Сго фосфаты, с которыми они контактируют, располагаются симметрично относительно центральной пары оснований операторного \частка.
Метод, основанный на использовании этилнитрозомочеви-ны для идентификации контактирующих с белками фосфатных групп, называется методом защиты от этилирования. Он позволяет определить влияние присоединения этильных групп к фосфатам, находящимся в различных положениях вдоль цепи ДНК, на последующее связывание белка. Даже если эти опыты свидетельствуют о контактировании того или иного фосфата с белком, следует всегда учитывать, что на самом деле этилирование фосфата может препятствовать связыванию с ним белка.
Мутантные операторы [2]
Во многих точках последовательности операторного участка длиной 17 пар оснований можно произвести замену пар оснований, приводящую к уменьшению эффективности связывания репрессора с данным участком. Много мутантных операторов содержат ДНК фагов Xvir, которые способны расти в присутствии ^.-репрессора. Первый из выделенных фагов Xvir содержал мутации в 0h 1, 0R1 и 0R2. Если в дальнейшем использовать этот фаг для отбора мутантов, способных расти при более высоких концентрациях репрессора, чем в данном лизогене, то можно выделить новые мутанты, несущие допол-
105
PrmUpi
PRM116
Рис 4 17 Мутации в области 0R Этот набор мутаций следует сравнить с последовательностями, приведенными в табл 2 2 Мутации в положении
3 приводят в основном к уменьшению эффективности связывания Сго, но не репрессора, а мутации в положениях 8 и 9-в основном к снижению эффективности связывания репрессора, но не Сго Мутации в остальных положениях оператора сопровождаются уменьшением связывания обоих белков Мутация PRMUp — 1 активирует промотор Рш в отсутствие репрессора, а мутация PRI4
Предыдущая << 1 .. 28 29 30 31 32 33 < 34 > 35 36 37 38 39 40 .. 56 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed