Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка):
После этого, как предполагалось, одна из зараженных культур клеток должна была бы синтезировать только один новый белок, /.-репрессор, а другая, инфицированная мутантом сГ , не должна была синтезировать ни одного нового белка. Действительно, когда одну из культур пометили 3Н-лейцином, а другую-14С-лейцином, затем клетки смешали,
90
ЫФ
/и
Разделение белков путем хроматографии на колонке
Рис 4 5 Выдезение X репрессора В действительности X репрессор бы i исход ю выдетен с помощью избирательного мечения репрессора присутствующего и к 1етке в ничтожном количестве Скорость синтеза репрессора по сравнению I. другими к юточными бетками была уветичена с помощью УФ об >учения к « это описано в тексте Мутант cl был использован для того чтобы подтвердить что меченый белок действительно является продуктом .ена сI
разрушили их и проанализировали содержимое, то обнаружили лишь один белок, меченный 3Н, но не |4С Репрессор составлял незначительную часть конечной смеси белков, но за его судьбой можно было следить благодаря его специфической радиоактивности Что же делал этот белок - продукт гена сР С помощью единственного эксперимента было показано, что он специфически связывался с коротким участком двухцепочечной ДНК фага X, содержащей соответствующие операторы Радиоактивно меченный продукт гена cl смешали с ДНК фага X в одной пробирке и с ДНК X гтт434 в другой и смеси по отдельности цетрифугировали в сахарозном градиенте (рис 4 6) В этих условиях молекулы, близкие по размеру к ДНК фага X, оседают гораздо быстрее, чем свободный репрессор, и эти два компонента легко разделить Оказалось, что
91
«<(
Направление седиментации
Рис 4 6 Специфическое связывание ^.-репрессора с ДНК фага X. Этот эксперимент показывает, что Х-репрессор связывается с ДНК фага но не с ДНК Ximm434 Аналогичным образом репрессор фага 434 связывается с ДНК фага Xwim434, но не с ДНК фага X Поскольку эти две ДНК различаются только областью иммунности, репрессоры связываются с участками, расположенными именно в этих областях Как показали дополнительные эксперименты. ДНК, выделенная из фага Xvir, связывает /,-репрессор гораздо слабее, чем ДНК фага X дикого типа Это подтверждает, что репрессор связывается с операторами фага X, выявленными генетическими методами
меченый белок движется вместе с быстро седиментирующей ДНК фага X, но не с ДНК X гтт434, которая седиментирует так же быстро. Напомним, что ДНК X тт отличается от ДНК фага X только короткой областью хромосомы, несущей гены cl, его и операторы (рис. 4.2). Результат этого эксперимента с убедительностью показывал, что ген с/ кодирует репрессор,
92
который специфически связывается непосредственно с оператором Кроме того, если ДНК подвергали денатурации, т.е. разделяли цепи двойной спирали нагреванием, совместной седиментации белка и ДНК не происходило. Следовательно, оператор должен представлять собой двухцепочечную ДНК.
Получение большого количества репрессора [12, 15, 56]
Чтобы изучать структуру репрессора, необходимо было прежде всего сконструировать штаммы Е. coli, образующие его в большом количестве, чтобы репрессор можно было легко выделять. Это стало возможным с появлением рекомбинантных ДНК. Ген с! был клонирован, т.е. вырезан из хромосомы фага X с помощью разрезающих ДНК ферментов (ферментов рестрикции), и встроен в плазмиду. Плазмида-это кольцевая молекула ДНК, гораздо меньшая, чем хромосома Е. coli, и представленная в каждой клетке в данном случае в количестве 25-50 копий. Плазмида реплицируется независимо от хозяйской днк, ее можно выделить из клеток, модифицировать и ввести в другие клетки.
Ферменты рестрикции А в
I 1 ..... .. - ДНК фага Л
\
к в
Г.. Фрагмент ДНК
\\ /у обеспечивающая
экспрессию
Рис 4 7 Плазмида, обеспечивающая синтез большого количества репрессора Она несет ген cl фага X, присоединенный к области промотора и оператора lai -оперона (Ор) При смешивании клеток Е coli с плазмидной ДНК последняя со сравнительно низкой частотой проникает в клетки В плазмиде присутствует ген устойчивости к антибиотику, поэтому в присутствии антибиотика растут только клетки, содержащие плазмиду, и их легко отобрать
93
Однако, если просто увеличить число копий гена cl, количество синтезированного репрессора увеличится лишь незначительно. Напомним (гл. 1), что при умеренно высоких концентрациях репрессор выключает свой собственный ген, связываясь с 0R3. Таким образом, чтобы получить очень много репрессора, нам придется заменить его обычный промотор /‘rm каким-либо иным промотором, который не находится под контролем Л-репрессора.
Как видно из рис. 4.7, мы выбрали промотор, с которого обычно считывается ген lacZ. Был выделен фрагмент ДНК, содержащий этот промотор вместе с сигнальными последовательностями, необходимыми для эффективной трансляции мРНК; затем этот фрагмент был присоединен к самому началу гена с/. Такая конструкция, введенная в клетки в составе рекомбинантной плазмиды, обеспечивала синтез большого количества репрессора. В настоящее время получены штаммы с модифицированным промотором lac (он называется tac). В этих клетках репрессор составляет до 20% всего синтезируемого клеточного белка и его легко выделить в чистом виде.
