Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Пташне М. -> "Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг" -> 33

Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.

Пташне М. Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг — М.: Мир, 1989. — 160 c.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка): pereklucheniegenov1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 27 28 29 30 31 32 < 33 > 34 35 36 37 38 39 .. 56 >> Следующая

Результаты этих двух опытов, как ни странно, в корне различаются. ДНК, добавленная до репрессора, в основном связывается с фильтром, а добавленная после-в основном нет. Если мы теперь продолжим инкубацию пробирок, отбирая время от времени пробы, то обнаружим, что ДНК, добавленная после репрессора, также постепенно начинает связываться с фильтром; на это уходит около часа.
Мы объясняем эти результаты следующим образом. В исходном концентрированном растворе значительная часть репрессора находится в виде димера. Если репрессор добавляют в раствор, уже содержащий ДНК, димеры быстро связываются с оператором, не успев диссоциировать на мономеры. Если же ДНК в пробирке отсутствует, то димеры диссоциируют на мономеры до тех пор, пока концентрация димеров не установится на гораздо более низком равновесном уровне, характерном для разбавленных растворов. Если теперь добавить ДНК, репрессор будет медленно связываться с опе-
100
Определение связывания с фильтром Определение связывания
через различные промежутки времени с срипьтром через различные
промежутки времени
Рис 4 14 Эксперимент с изменением порядка добавления компонентов Мономеры репрессора связываются с ДНК медленно, поскольку они вначале ютжны образовать димеры, а этот процесс при низкой концентрации репрес-м идет медленно Димеры связываются с ДНК быстро Если ДНК ш^чтетвует в смеси до добавления репрессора. димеры успевают связаться еще до диссоциации
а 1 ором и лимитирующей стадией станет образование ди-'грного промежуточного продукта.
Оценки константы равновесия реакции димеризации (2) 1кл величину Кх = 2- 10~8 М. Зная эту величину и количество репрессора, необходимое для связывания половины максима 1Ыюго количества ДНК в экспериментах, подобных приведенному на рис. 4.12, можно вычислить К2 . Для связывания
- 0R 1 в условиях, близких к внутриклеточным, т.е. при 0,2 М kC'l и 37 С, /С2=3-10~9М. В этих условиях время жизни комплекса репрессора с оператором составляет величину порядка нескольких секунд. При более низких температуре и концентрации соли, когда связывание прочнее, время жизни комплекса достигает минут и даже часов.
101
С ДНК контактирует 'Н-концевой домен [23, 45, 58]
Весьма полезным методом изучения ДНК-белковых взаимодействий является так называемый футпринтинг (рис. 4.15). Некий белок, связанный с определенным участком ДНК, защищает его от расщепления, например, ДНКазой, которая в обычных условиях случайным образом вносит в ДНК одноцепочечные разрывы. На практике обычно вначале получают фрагменты ДНК, меченные 32Р по одному из концов одной цепи. Затем добавляют такое количество ДНКазы, чтобы внести в каждую молекулу в среднем не более одного разрыва, ДНК денатурируют и проводят гель-электрофорез.
В геле образуется «лесенка», причем каждая следующая ступенька, считая снизу вверх, отвечает цепочке ДНК, отщепленной на один нуклеотид дальше от меченого конца, чем предыдущая. Если теперь провести такой же эксперимент в присутствии репрессора, то в том месте «лесенки», которое соответствует участку ДНК, связанному с репрессором, поя-
Нерасшепленный
фрагмент
Денатурация Гель-электрофорез Радиоавтография
Пропуск
Нерасщелленный
фрагмент
Рис. 4.15. ДНКазный футпринтинг. Продукты реакции выявляют с помощью радиоавтографии, поэтому немеченая ДНК не обнаруживается. После гель-электрофореза образуется «лесенка» из полос, каждая из которых соответствует цепочке ДНК, на один нуклеотид более длиной, чем в следующей «ступеньке», если идти сверху вниз.
102
вится пробел (отпечаток, или футпринт) Другими словами, там, где связан репрессор, ДНКаза не может внести разрыв в ДНК, и поэтому фрагменты, которые образуются в результате расщепления чистой ДНК в этом участке, отсутствуют
Сходный метод изучения ДНК-белковых взаимодействий основан на использовании метилирующего агента диметил-сульфата (ДМС) В двухцепочечной ДНК ДМС переносит метальную группу главным образом на атомы двух оснований, G и A G метилируется по атому, выступающему в большой желобок (азот N7 согласно общепринятой нумерации атомов), а А-по атому, выступающему в малый желобок (азот N3)
сторона
I
GACTAT ТТ СТ6АТА АА
ТАССТСТО А Т 6#Д#А С
Задняя
сторона
: с#с с а с'
IAT А Т А Т
ATG6TT6
ТАССААС
OrI
Рис 4 16 Участки оператора, контактирующие с репрессором Внизу приведена нуктеотидная последовательность оператора и отмечены звенья G, которые репрессор защищает от метилирования диметилсульфатом Эти защищенные звенья показаны на спирали ДНК Четыре из звеньев G, участвующих во взаимодействии, видны в большом желобке на передней стороне спирали G в положении 11 не просматривается, но, подобно другим G на этой стороне спирали, он должен контактировать с а-спиралью, лежащей в большом желобке с этой стороны Еще два звена, контактирующие с репрессором, лежат на задней стороне спирали На рисунке показаны также фосфатные группы, взаимодействующие с репрессором Ромбиком отмечена ось симметрии второго порядка
Предыдущая << 1 .. 27 28 29 30 31 32 < 33 > 34 35 36 37 38 39 .. 56 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed