Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка):
оператора Ок фага X, связанного с Сго
Лш Vp - 1 0» 3 0R 2 0R1 PR
Включен Включен
Выключен X Включен
Выключен X X Выключен
Выключен X х Выключен
Выключен X X х Выключен
выключает PR, а связываясь с 0R3, выключает PRM. Эти данные вместе с данными о порядке связывания с разными участками 0R (рис. 1.23) позволяют судить об основных физиологических состояниях оператора, связанного с Сго. Соответствующие сведения приведены в табл. 4.5.
Белок Сго in vitro [32, 62, 63]
Сго образует стабильный димер, и нет никаких данных, что он состоит более чем из одного домена; об этом же свидетельствуют результаты рентгеноструктурного анализа (рис. 2.9). Эксперименты по футпринтингу показывают, что Сго связывается некооперативно с тремя участками 0R и с тремя участками 0Ь. По сродству к Сго участки 0R располагаются в порядке, указанном на рис. 1.23, т.е. 0R3 > 0R2 = 0R 1, а участки 0L~в порядке 0L 1 > 0L 2 = 0L 3. В 0,2 М КС1 при 37°С Сго связывается с 0R 3 так же прочно, как димер репрессора с 0R1. Сродство Сго к Ок2 и 081 примерно на порядок ниже, чем к 0R3.
Сго блокирует транскрипцию с промотора PR, но только при добавлении его в смесь, содержащую ДНК, до полимеразы. Для проявления такого эффекта Сго должен связаться с участками 0R1 и 0R 2, а удаление участка 0R 3 никак не сказывается на подавлении PR. При введении до полимеразы Сго блокирует транскрипцию с РRM независимо от того,
117
содержит ли матрица нормальные участки 0R 1 и 0R 2, несущие репрессор, или используется мутантная матрица PRMUp— 1. Этот вид репрессии не проявляется, если участок 0R 3 мутантен и Сго не может с ним связаться.
Белок Rec А расщепляет репрессор и тем самым запускает индукцию (рис. 1.21) [16, 36, 57, 59]
После индукции в лизогенных клетках дикого типа расщепленный репрессор можно обнаружить в клеточных экстрактах. Необходимым условием расщепления являются УФ-облучение и наличие продукта гена гес А. Если клетка-хозяин повреждена, так что ген гес А инактивирован, репрессор не расщепляется и индукция фага становится невозможной. В случае клеток, несущих некоторые мутантные формы гена гес А, УФ-облуче-ние в определенных условиях может не понадобиться: индукция лизогенов в этом случае происходит просто при повышении температуры, без всякого облучения.
Расщепление репрессора можно провести in vitro с помощью очищенного белка Rec А. Х-Репрессор расщепляется между остатками Ala и Gly в положениях 111 и 112; этот процесс стимулируется короткими одноцепочечными фрагментами ДНК и АТР.
Некоторые другие репрессоры, в том числе репрессор фага 434 и белок Lex А, также можно расщепить in vitro, причем и в этих случаях расщепление происходит между остатками Ala и Gly, расположенными в пептиде, соединяющем два домена. При pH 10 эти репрессоры могут расщепляться по указанной связи и спонтанно; при pH 7,0 реакция идет медленно, но значительно ускоряется в присутствии очищенного белка Rec А.
Степень расщепления репрессора в лизогенных клетках определяют в опытах по связыванию с фильтрами. Расщепления 30% молекул недостаточно, чтобы вызвать эффективную индукцию, для этого необходимо, чтобы расщепилось 80% молекул репрессора.
Связывание Сго с 0,3 запускает механизм переключения (рис. 1.24) [5]
Связывание Сго с 083 играет ключевую роль в индукции. Об этом свидетельствуют следующие два эксперимента.
В первом из них использовали фаг X, мутантный по 0R 3, с которым не может связываться Сго. Такой фаг дает обычные по виду мутные бляшки, но содержащие его лизогенные клетки очень слабо индуцируются при УФ-облучении. Это означает,
118
что для эффективной индукции необходимо, чтобы Сго связывался с 0R3.
В ходе второго эксперимента использовали плазмиду, детерминирующую синтез Сго под контролем lac-репрессора. Эту плазмиду вводили в одном случае в лизогенные клетки дикого типа, а в другом-в лизогенные клетки, мутантные по 0R 3. Когда синтез Сго индуцировали добавлением ИПТГ, происходила индукция только лизогена дикого типа, но не мутантного лизогена. Таким образом, связывание Сго с 0R3 запускает индукцию.
Репрессор и Сго связываются с оператором так, как это показано на рис. 2.6, 2.8 и 2.10
Эти рисунки иллюстрируют не только идентичность конфигурации представленных комплексов, но и то, что именно аминокислоты, расположенные в узнающих спиралях (а также в «руках» ^.-репрессора), определяют специфичность связывания с данной последовательностью. Эти два близких аспекта исследуют с помощью рентгеноструктурного анализа и биохимических экспериментов.
Рентгеноструктурный анализ [13, 14, 17, 40, 49]
Структура N-концевых доменов репрессора и Сго в кристаллах установлена с высоким разрешением. Как видно из рисунков гл. 2, имеет место структурное соответствие между ними и В-формой ДНК. Согласно пространственной модели еще одного специфического ДНК-связывающего белка Е. coli, белка-активатора катаболизма (БАК), контакт между ним и ДНК тоже осуществляется посредством биспирального элемента, описанного в гл. 2. Во всех случаях одна из а-спиралей (узнающая) укладывается в большой желобок, а другая располагается поперек него. Адекватность этих моделей ДНК-бел-ковых комплексов подтверждают результаты рентгеноструктурного анализа комплекса репрессора с оператором в кристаллах. В состав исследованного комплекса входил репрессор фага 434, близкородственного фагу X; о нем уже шла речь в этой книге.
