Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка):
Сго вначале связывается с 0R3, а затем с 0R1 и 0R 2; таким образом, он вначале выключает PRM, а затем PR (рис. 4.23)
Некоторые общие сведения о белке Сго [79, 20, 22, 31, 47, 44, 56]
Одно из первых указаний на существование белка Сго было получено при проведении следующего генетического эксперимента (рис. 4.23). В лизогенных по фагу X клетках, несущих температурочувствительную мутацию в гене cl, была удалена большая часть генов слева от с/ и справа от его. О присутствии интактного гена cl свидетельствовала иммунность клеток к фагу X при низкой температуре (30°С).
Если клетки выращивали при 42°С, т.е. в условиях, когда мутантный репрессор неактивен, у них наблюдались неожиданные свойства: клетки не только не были иммунными, как
114
ожидалось, но они были «антииммунными». Это означает, что фаг X дикого типа, который вообще не мог расти на этом ш гамме при 30°С, при 42°С давал только прозрачные бляшки. Эффект оказался чувствителен к типу иммунности: например, фаг Ximm434 образовывал на этом штамме нормальные мутные бляшки при обеих температурах.
Из всего этого можно было сделать только один вывод: оставшийся в бактерии участок фагового генома кодирует какой-то фактор, специфичный по отношению к области иммунности фага X, который направляет развитие заражающих клетки фагов X по логическому пути. В зависимости от характера эксперимента этот фактор обозначали по-разному: Ai (01 англ. anti-/mmunity - антииммунность); Tof (от англ. /urn off-выключение) или Сго. Теперь мы знаем, что единственный ген его, транскрибируемый с промотора PR, обеспечивает образование достаточного количества белка Сго, чтобы клетка стала антииммунной. Антииммунность является, очевидно, следствием частичного подавления промоторов PL и PR под действием Сго и связанной с этим пониженной экспрессии генов ell и сШ.
Обсудим состояние правых оператора и промотора в таких антииммунных клетках. При связывании Сго выключает PR, но по мере роста и деления клеток концентрация Сго уменына-егся и PR снова включается. Так устанавливается состояние динамического равновесия, когда скорость синтеза Сго в точности равна скорости его разведения и, по всей вероятности, поддерживается его постоянная концентрация. В эюм случае Сго снижает, но не подавляет полностью свой собственный синтез.
30°С 42°С
Иммунное состояние Антииммунное состояние
Рис 4.23 Иммунность и антииммунность Клетки содержат мутантный репрессор R, который хорошо работает при ЗСГС, но денатурирует при 42 С. При повышенной температуре включается синтез белка Сго (на рисунке он обозначен буквой С), но клетки не лизируются, так как все остальные фаговые гены удалены. Белок Сго направляет проникающие в клетку фаги по ли-тическому пути развития Если понизить температуру до 30°С, клетки снова переходят в иммунное состояние.
115
8:
Исходно белок Сго был выделен из клеток, где шла литическая инфекция, в опытах по связыванию с фильтрами. Это был один из белков, которые специфически связывались с ДНК фага X. Соответствующий ген был клонирован и соединен с различными призводными /ас-промотора. В клетках, содержащих такие плазмидные конструкции, Сго может синтезироваться в различных количествах. Если содержание белка достаточно высоко (до нескольких процентов суммарного количества), его легко выделить, и многие биохимические подходы, использованные в случае репрессора, были применены и при изучении Сго.
Белок Cro in vivo 142-]
Клетки, несущие плазмиды, которые детерминировали синтез Сго под контролем lac-репрессора, использовались для изучения влияния Сго в различных концентрациях на промоторы Ркм и Рк in vivo. Результаты одного такого эксперимента, аналогичного представленным на рис. 4.20, показали, что под действием Cro РRM выключается (в данном случае использова-ли Ркм Up — 1), а при более высокой концентрации выключается также PR (рис. 4.24). Используя мутантные операторы аналогично тому, как это было в случае с репрессором, удалось установить результат связывания Сго с каждым из операторных участков 0R по отдельности (табл. 4.4).
Итак, в качестве белка с негативным регуляторным эффектом Сго идентичен репрессору: связываясь с 0R1 и Ок2, он
321321 с С 321 3 2 1
Концентрация Сго—>
Рис. 4 24 Регуляторное действие белка Cro in vivo. Ген его можно ввести вместо гена cl в бактериальные клетки (см рис. 4 19) и, добавив ИПТГ, индуцировать синтез Сго Используя конструкции PR-lacZ и PKMUp - \-lac Z, можно показать, что Сго оказывает негативное действие на оба промотора
фага L
116
Таблица 4.4. Влияние связывания димера Сго с единственным участком 0R. В отсутствие репрессора или Сго (верхняя строка) ,PRM и PR включены, поскольку был использован мутант PRMUp — 1
Лш Up - 1 0„2 0R1 Рк
Включен Включен
Включен X Выключен
Включен X Выключен
Выключен X Включен
Таблица 4.5. Физиологически важные состояния
