Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Пташне М. -> "Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг" -> 41

Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.

Пташне М. Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг — М.: Мир, 1989. — 160 c.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка): pereklucheniegenov1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 56 >> Следующая

Генетические эксперименты также указывают, что «руки» репрессора образуют как минимум один специфический контакт с задней стороной ДНК. Так. наличие мутации в 0R 1 по положению 8 снижает сродство репрессора, имеющего нормальные «руки», но не влияет на репрессор, лишенный трех N-концевых остатков. Таким образом, «руки» вносят свой вклад как в энергию, так и в специфичность связывания. Исследования свободного, т. е. не связанного с оператором, репрессора с помощью ЯМР показывают, что «руки» имеют гибкую, подвижную конформацию.
122
Специфические контакты аминокислот с основаниями [6, 18, 28, 46, 67]
Построение детальных моделей взаимодействия репрессора и Сго, основанных на данных об их структуре, позволяет предположить, какие контакты возникают между узнающими спиралями и парами оснований оператора. Одно из затруднений на этом пути состоит в том, чтобы установить точное взаимное пространственное расположение а-спирали и ДНК. Например, на рис. 2.11 предполагается, что Ser в положении 2 а-спиралей обоих белков контактирует с основанием в положении 4 оператора, a Lys в положении 6 контактирует с основаниями в положениях 5 и 6. Согласно более ранней модели, а-спираль Сго сдвинута так, что Ser и Lys контактировали соответственно с основаниями в положениях 3, 4 и 5 оператора. Простое рассмотрение моделей не позволяет решить, какой из вариантов расположения спирали правильный и соответсгв\ет ли вообще какой-либо из них действительности.
Эксперимент, в котором использовали специально ckoiici-руированные мутантные белки и метилирование с помощью ДМС, частично подтвердил модель, изображенною iki рис. 2.11, а именно что Ser в положении 2 \ знающей спирл ш взаимодействует с основанием в положении 4 опера юра. Нуклеотидные последовательности генов репрессора и Сго модифицировали таким образом, чтобы они кодировали мутантные белки. Оба мутанта содержали в положении 2 узнающей спирали Ala вместо более объемного и совершенно иного по своей химической природе остатка Ser. Мутантные Сго и репрессор получили в очищенном виде и использовали в опытах in vitro. Было проведено сравнение мутантных белков с белками дикого типа по их способности защищать ДНК от метилирования. Этот эксперимент в принципе аналогичен опыту с использованием этилнитрозомочевины (см. ранее). Он состоит в том, что вначале проводят метилирование оператора при помощи ДМС так, чтобы на одну молекулу ДНК приходилась одна метальная группа, а затем добавляют репрессор или Сго. Операторные фрагменты, связавшиеся с белком, задерживаются на нитроцеллюлозном фильтре, и метилированные основания в них идентифицируют с помощью расщепления и гель-электрофореза (ср. этот подход с тем, который проиллюстрирован на рис. 4.15). Если метилирование какого-либо основания препятствует связыванию белка, полоса в геле, соответствующая определенному положению в операторе, отсутствует.
Этот эксперимент показал, что метилирование G в положении 4 оператора подавляет связывание репрессора и Сго дикого типа, но не оказывает никакого действия на связывание мутантных белков. Оба мутантных белка связываются слабее,
123
чем их аналоги дикого типа, но метилирование основания в положении 4 не влияет на связывание мутантных белков. Метилирование же других оснований оператора подавляет связывание как мутантных белков, так и белков дикого типа.
Репрессор активирует транскрипцию гена cl, связываясь с 0,2и контактируя с полимеразой своим N-концевым доменом (рис. 1.12, 1.19, и 2.17)
Мутации, нарушающие позитивную регуляцию [24, 25, 27, 52]
Для объяснения механизма стимуляции транскрипции каким-либо ДНК-связывающим регуляторным белком можно предложить две гипотезы. Согласно первой, связывающийся белок каким-то образом меняет конформацию ДНК, и она становится более подходящим субстратом для РНК-полимеразы. Вторая модель, наоборот, предполагает, что связанный белок стимулирует транскрипцию, контактируя с полимеразой. Против первой модели существует одно возражение: как мы и предполагали, по данным рентгеноструктурного анализа л-репрессор очень мало изменяет конформацию ДНК при связывании. Еще один аргумент против этой модели был получен при изучении мутантов по гену репрессора, которые обозначаются рс (от англ. positive control - позитивная регуляция).
Мутантные репрессоры рс нормально связываются с ДНК, но не могут активировать транскрипцию; такие мутанты были выделены и в случае А,-репрессора, и в случае репрессора фага Р22. Во всех случаях мутации затрагивают аминокислотные остатки, которые, как предполагается на основании структурных исследований и других данных, расположены вблизи от полимеразы и, возможно, соприкасаются с ней. Таким образом, данные по этим мутантам служат дополнительным подтверждением справедливости наших представлений о комплексах репрессоров с операторами в тех двух случаях, о которых идет речь.
На рис. 4.27 указаны фосфатные группы, которые предположительно контактируют с полимеразой, связанной с РRM, и с ^-репрессором, связанным с 0R 2 и 0R 1. Когда эти белки исследуют по отдельности, и с А-репрессором, связанным с Ок2, и с полимеразой контактирует один фосфат. Следовательно, этот фосфат расположен скорее всего вблизи от участка взаимодействия между двумя указанными белками. Если мы поместим димер репрессора на 0R 2, то обнаружим, что измененные аминокислотные остатки всех ромутантов А-репрессора расположены на том участке поверхности, кото-
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 56 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed