Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка):
97
7 П31
100%
Связанная
ДНК
о%
/ /------Сигмоидная кривая
Концентрация репрессора
Рис 4 12 Связывание репрессора с ДНК Штриховая кривая-пример так называемой кривой Михаэлиса Ментен Она описывает реакцию связывания когда димер репрессора стабилен при любых концентрациях и с операторным участком 0R1 связывается единственный димер В действительности свя зывание с ДНК фага К описывается сигмоидной кривой (Строго говоря под концентрацией репрессора должна подразумеваться концентрациям свобод ного репрессора [R] т е общая концентрация репрессора [RT] минус кон центрация репрессора связанного с оператором [0R] Однако в данном случае репрессор находится в большом избытке по отношению к оператору поэтому
[R] * [RJ)
шинству других белков, остается на нем ДНК, связанная с белком, задерживается на фильтре, и если она помечена радиоактивным изотопом (например, 32Р), легко измерить, какая часть ДНК и, следовательно, репрессора задерживается на фильтре при различных условиях Например, при высокой концентрации ДНК, когда все молекулы репрессора связаны, зная число молекул ДНК, задержавшихся на фильтре, можно определить число активных, т е способных связывать ДНК, молекул репрессора в данном препарате
На рис 4 12 приведена зависимость доли связанных с репрессором молекул ДНК, несущих единственный операторный участок 0R1, от концентрации репрессора Кривая построена по данным связывания ДНК с фильтрами Для того чтобы получить каждую точку этой кривой, смесь репрессора при данной концентрации и ДНК инкубировали до достижения равновесия, а затем проводили фильтрацию Удивительная особенность этой кривой заключается в том, что она имеет S-образную, или сигмоидную, форму и отличается от кривой, ожидаемой, например, для случая, когда для связывания ДНК с фильтром достаточно, чтобы с оператором был связан один мономер репрессора, или, что то же самое, когда димер репрессора совершенно стабилен Такая кривая изображена на рисунке штриховой линией
Проанализируем штриховую кривую на рис 4 12 более
98
ln[R]
Рис 4 13 Анализ сигмоидной кривой связывания После преобразования уравнения (4) имеем [R]2/^ = [R20] [0] Таким образом зависимость 21n[R] от ln[R20]/[0] должна изображаться прямой с наклоном 2, как это и имеет место в действительности Если бы репрессор связывался в виде тетрамера накчон прямой был бы равен 4 Этот график представляет собой ту же сигмоидную кривую, что и на рис 4 12 но построенную в других
координатах
подробно Эта кривая должна соответствовать следующей простой реакции
[О] [R]
RO^O + R, К = - ¦ J, (1)
[OR] ’
где [R] - концентрация репрессора, [О]-концентрация оператора, К-константа равновесия реакции (обратите внимание, что здесь, как и во всей книге, мы представляем константу равновесия как константу диссоциации) Величина К равна концентрации репрессора в средней точке кривой, т е при [О] = [OR]
Почему же кривая, описывающая взаимодействие Л-репрес-сора со своим оператором, имеет сигмоидную формуй Дело в юм, что эта реакция идет не в одну стадию, как предполагает уравнение (1), а в две Первая из них-димеризация двух мономеров репрессора, а вторая-связывание димера с оператором
Димеризация
R2-2R, *1=® (2)
L^2J
Связывание с оператором
R2o-R2 + o, к2 = [^о°] (3)
99
7’
Таким образом, суммарную реакцию можно представить в виде
[R]2[О]
R20 = 2R + О, К = К,К2 = '--^-±—, (4)
1 2 [R20]
где [R]-концентрация мономера репрессора, [R2]-концентрация димера.
В соответствии с этой моделью димеры А-репрессора, способные прочно связываться с ДНК, легко диссоциируют на мономеры, которые связываются с ДНК очень слабо. Таким образом, при низкой концентрации репрессор не может связаться с ДНК, поскольку находится преимущественно в виде мономера. При увеличении концентрации мономеры ассоциируют, образуют димеры и связываются с оператором.
Из уравнения (4) следует, что если представить данные рис. 4.12 в виде зависимости ln[R20]/[0] от ln[R], то должна получиться прямая с наклоном 2. Именно такая прямая изображена на рис. 4.13.
Димер образуется до связывания с ДНК и, 4, 5/]
Эксперименты, подобные изображенному на рис. 4.14, мы называем экспериментами с изменением порядка введения компонентов. Концентрированный раствор репрессора разводят, например, в 100 раз в двух пробирках. В одной пробирке содержится меченая операторная ДНК, в другой -нет. Во вторую пробирку добавляют меченую ДНК, смеси фильтруют и определяют содержание комплекса репрессор-оператор.
