Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка):
Основные положения гл. 1 и 2
Репрессор состоит из двух глобулярных доменов, соединенных мостиком примерно из 40 аминокислот (рис. 1.6) [50, 64]
При обработке очищенного репрессора какой-либо про-теазой, например папаином, образуются два сравнительно устойчивых фрагмента (рис. 4.8). Анализ их аминокислотной последовательности показывает, что один из этих фрагментов происходит из N-концевой части репрессора (остатки 1-92), а другой-из С-концевой (остатки 132-236).
Оба фрагмента ведут себя как типичные глобулярные белки, и их можно легко разделить. Плотно упакованные участки белков обычно более устойчивы к протеазам, чем участки, находящиеся в развернутой конформации, поэтому эксперименты по расщеплению позволяют показать, что N- и С-концевые участки образуют два отдельных домена.
При повышении температуры белки или их домены переходят в неупорядоченное состояние (денатурируют), причем каждый домен обладает своей собственной характерной температурой денатурации. Если измерять температуру денатурации для каждого из доменов по отдельности, то окажется, что N-концевой фрагмент репрессора денатурирует при температуре примерно на 20°С ниже, чем С-концевой (рис. 4.9).
При нагревании интактного репрессора наблюдаются два отдельных пика денатурации, которые в точности соответ-
94
н
Интактный
мономер
-с-концевой домен -N-концевой домен
Рис. 4.В. Протеолитическое расщепление Х-репрессора. Один из способов выявления доменов в составе какого-либо белка состоит в том, чтобы выяснить, не содержит ли он участки, сравнительно устойчивые к протсолизу Папаин легко расщепляет сегмент Х-репрессора с 93 по 131 остаток, но N- и С-концевая области не расщепляются. Эти домены можно разделить с помощью гель-электрофореза, поскольку они имеют разный размер и образуют в геле две полосы.
Температура —>
Рис. 4.9 Денатурация Х-репрессора и его выделенных доменов. Разворачивание молекулы Х-репрессора происходит в два этапа при двух разных температурах, которые соответствуют температурам денатурации изолированных доменов. (Денатурацию исследуют с помощью прибора, который называется сканирующим калориметром. При денатурации происходит поглощение тепла, изменение количества которого по мере увеличения температуры и измеряет сканирующий калориметр.)
ствуют пикам денатурации изолированных фрагментов. Следовательно, даже в составе интактной молекулы домены денатурируют более или менее независимо Исследования с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) также указывают, что связь N- и С-концевого доменов в составе интактного репрессора отличается значительной гибкостью.
Репрессор димеризуется главным образом благодаря взаимодействию С-концевых доменов (рис. 1.7) [1, 4, 50]
Анализ с помощью гель-фильтрации и седиментации показывает, что при низкой концентрации (10“9 М) репрессор находится преимущественно в виде мономера, при более высокой (10“7 М) - преимущественно в виде димера, а при очень высокой концентрации (10“5 М)-в основном в виде тетрамера Выделенные С-концевые домены (остатки 132-236) образуют димеры и тетрамеры почти столь же эффективно, как и интактные мономеры, а N-концевые домены к этому не способны (рис. 4.10). Некоторые взаимодействия между N-концевыми доменами выявляются с помощью рентгеноструктурного анализа
Учитывая, что константа равновесия для димеризации интактного репрессора равна К = 2 10“8 М (см. ниже), а концентрация репрессора в лизогенных клетках составляет примерно 4 ¦ 10— т М, можно заключить, что около 95% репрессора в этих клетках находится в виде димера и 5% - в виде мономера Концентрация репрессора, при которой половина молекул находится в виде тетрамера, по крайней мере в 100 раз выше, чем его концентрация в лизогенных клетках, поэтому in vivo образуется очень мало тетрамеров репрессора.
Рис 4 10 Димеризация расщепленного /.-репрессора Расщепление папаином практически не сказывается на способности С-концевого домена /.-репрессора
к димеризации
96
Димер репрессора связывается своими N-концевыми доменами с операторным участком длиной 17 пар оснований (рис. 1.9)
Рис. 1.9 предполагает, что установлены три важных факта.
• Во-первых, один операторный участок связывает один димер репрессора.
• Во-вторых, димер образуется до связывания мономеров с ДНК, т. е. мономеры не связываются с ДНК по отдельности.
• В-гретьих, с ДНК контактирует только N-концевой домен. Рассмотрим эти три положения по отдельности.
Один операторный участок связывает один димер репрессора U, 4, 55]
Важный подход к анализу связывания ДНК с белками основан на изучении связывания их с нитроцеллюлозными фильтрами (рис. 4.11). Этот метод позволяет аккуратно определять концентрации компонентов в состоянии равновесия и кинетические параметры реакций.
Метод основан на том, что двухцепочечная ДНК свободно проходит через фильтр, тогда как репрессор, подобно боль-
Рис. 4.11. Анализ связывания ДНК с белками методом фильтрации. ДНК несет радиоактивную метку, а белок-нет. Чем выше концентрация белка, тем больше ДНК задерживается на фильтре.
