Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
tPHK^ua и гомологичной аминоацил-тРНК-синтетазы, равно как и саму дигидрофолатредуктазу, ген которой содержал требуемую амбер-мутацию. При культивировании таких клеток в среде, где содержание p-F-Phe было значительно больше, чем Phe, дрожжевая синтетаза аминоацилировала гомологичную
Г)|_ _
тРНКсиА , что обеспечивало эффективную супрессию амбер-ко-дона. Выход модифицированного белка в такой системе составлял 8-12 мг/л бактериальной культуры [42]. Хотя такой метод получения модифицированных белков не является универсальным, с его помощью можно вводить стабильную изотопную метку в виде 19F-Phe в белки для их дальнейшего исследования с помощью ЯМР-спектроскопии.
Несмотря на большой потенциал, обсуждаемая группа методов TRAMPE из-за ряда недостатков пока еще не получила широкого распространения в современной белковой инженерии. Для дальнейшего внедрения этих методов требуются усовершенствования в дизайне тРНК, подвергающейся аминоацилированию, разработка более эффективных химических методов аминоаци-лирования тРНК неприродными аминокислотами, а также повышение производительности самих систем биосинтеза модифицированных белков. Работы в данном направлении не прекращаются, а, следовательно, и прогресс в этой области исследований неизбежен.
Химическая модификация мутантных белков, полученных сайт-специфическим мутагенезом. Комбинированное использование методов направленного мутагенеза и химической модификации боковых цепей мутантных белков, полученных первым методом, дает возможность включать в полипептидные цепи неприродные аминокислотные остатки, что не может быть реализовано каждым из этих методов в отдельности. При таком подходе с помощью направленного мутагенеза в исследуемый участок полипептидной цепи вводят остаток природной аминокислоты, содержащий легко модифицируемую функциональную группу (например, остаток Cys), которую далее изменяют химическими методами.
Остаток Cys в составе белковой молекулы можно тиоалкили-ровать с помощью метантиосульфоната (CH3S02S-R), который
специфически и количественно реагирует с сульфгидрильными группами. Этот метод, особенно пригодный для белков, не содержащих природных SH-групп, был успешно применен для модификации субтилизина [43]. Кроме того, остатки Cys, образовавшие дисульфидные связи и расположенные внутри белковых глобул, после таких манипуляций остаются интактными. Замена остатков Cys на Ser в том случае, если первые не входят в состав активного центра, как правило, является нейтральной по отношению к ферментативной активности мутагенизируемого белка. Это дает дополнительную возможность специфической модификации конкретных остатков Cys после предварительной замены части лишних остатков направленным мутагенезом.
Обсуждаемый комбинированный подход к модификации белков может быть использован для изменения окружения активного центра ферментов, исследования топологических особенностей белковых молекул и их стабилизации. В частности, с помощью этой группы методов удается манипулировать активностью, специфичностью и pH-оптимумом субтилизина, а также конструировать комбинаторные клонотеки белков, в которых исследуемая полипептидная цепь целенаправленно сканируется остатком Cys [44].
1.3. Химико-ферментативный синтез в создании полусинтетических полипептидов: лигирование синтезированных белков
Разработанный в 1998 г. подход к получению модифицированных белков, получивший название “лигирование синтезированных белков” (expressed protein ligation, EPL), оказал и продолжает оказывать большое влияние на развитие белковой инженерии [45]. Так же, как и рассмотренный выше метод нонсенс-су-прессирующего мутагенеза, EPL позволяет вводить в белки неприродные аминокислотные остатки и получать модифицированные полипептидные цепи, которые трудно, а порой и невозможно, создать другими имеющимися методами. Метод EPL основан на ковалентном соединении друг с другом полипептидов, полученных химическим синтезом или с использованием технологий рекомбинантных ДНК, что сопровождается образованием требуемого модифицированного белкового продукта. Возможность такой сборки достигается введением на соответствующие концы объединяемых полипептидов реакционноспособных групп, обеспечивающих образование ковалентных связей в водных растворах при физиологических значениях pH.
1.3.1. Полусинтетические белковые молекулы
в создании новых полипептидов
Метод EPL является одной из разновидностей подхода, получившего название полусинтеза (semisynthesis) белков. Он включает в себя группу методов, позволяющих осуществлять сайт-специфические модификации белковых и пептидных молекул, включая объединение фрагментов полипептидных цепей, полученных протеолитическим или химическим гидролизом исходных белковых молекул. В одном из простых вариантов полусинтеза методом направленного мутагенеза в требуемый участок полипептидной цепи вводят остаток Cys, который далее модифицируют химическим зондом, специфически взаимодействующим с сульфгидрильной группой этого аминокислотного остатка. С помощью таких подходов удается вводить в исследуемые участки полипептидных цепей фотоактивируемые химические группы, осуществляющие поперечные сшивки полипептидных цепей [46], флуорофоры [47], а также создавать фотоловушки для ферментов, т.е. получать белки, сайт-специфически меченные флуоресцентными зондами [48].
