Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 129

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 123 124 125 126 127 128 < 129 > 130 131 132 133 134 135 .. 221 >> Следующая

Дальнейшее усовершенствование стратегии полусинтеза белков было сделано Р. Оффордом и К. Роузом [56], которые впервые использовали химию гидразонов и оксимов для лигирования синтетических и рекомбинантных пептидов. При полусинтезе (комбинированном синтезе) модифицированного колоний-стиму-лирующего фактора гранулоцитов (G-CSF) вначале с помощью специфического протеолиза по связям Lys-Ser рекомбинантного фактора были получены фрагменты его полипептидной цепи. С помощью периодатного окисления на N-концах пептидов были получены альдегидные группы, а на С-концах с использованием обратного протеолиза - гидразиды. Такие производные легко лигируются друг с другом с образованием исходного полипептида длиной в 174 а.о., обладающего биологической активностью. При этом ряд исходных пептидных фрагментов можно было заменять на искусственно полученные химическим синтезом и содержащие модифицированные аминокислотные остатки. Сила подхода, основанного на химии гидразонов и оксимов, заключается в его универсальности. Вышеупомянутые модификации N- и С-концов пептидов могут проводиться в присутствии любых боковых групп природных белков и не требуют их специальной защиты. Именно это существенно облегчило химический синтез белков и легло в основу группы современных методов, получивших название лигирования синтезированных белков, которые будут подробнее рассмотрены ниже.
Еще один подход, позволяющий осуществлять лигирование полностью незащищенных пептидов в водных растворах при нейтральных значениях pH, был разработан в лаборатории С. Кента в 1994 г. [57]. В этом случае на первом этапе проводят химиосе-лективную реакцию между пептидом, содержащим N-концевой
ф
ф h2n^nh2
NH3 NH ОН
H3N-
in;
CONH
Спонтанный S -> N-перенос ацила
e
H,N4
e
NH
i
®
H,N
NH,
NH
1
OH
±
SH
T
CO
©

NH CONH
e H2V
NH3 NH
______L_
-| Пояипепт
CO,®
NH,
OH
1
co,
ftic. 38. Лигирование нативных белков [45]
Оба полностью незащищенных пептида реагируют друг с другом при нейтральных значениях pH; пептид справа содержит N-концевой остаток Cys, пептид слева - С-концевую тиоэфирную группу; изображены незащищенные боковые функциональные группы аминокислотных остатков; в квадратных скобках показано промежуточное соединение, спонтанно претерпевающее перестройку; один из объединяемых пептидов может быть синтетическим, другой - природным
остаток Cys (a-Cys), и вторым пептидом, содержащим а-тиоэ-фирную группу на С-конце. Первоначальная реакция транстиоэ-терификации (рис. 38) сопровождается спонтанной внутримолекулярной перестройкой (ацильное смещение S —> N) с образованием амидной связи. Методики, основанные на этой реакции, в последнее время претерпели множество усовершенствований, что сделало данный подход еще более эффектным и эффективным [58, 59].
1.3.2. Сплайсинг и транс-сплайсинг белков
в лигировании пептидов
Белковый сплайсинг представляет собой природный постран-сляционный процесс, в котором белок-предшественник претерпевает спонтанную внутримолекулярную перестройку, в результате которой происходит точное удаление внутреннего сегмента полипептидной цепи (интеина) и лигирование внешних пептидов (экстеинов) друг с другом [60]. Как правило, сплайсинг белков не требует присутствия специфических последовательностей аминокислот в экстеинах. В отличие от этого, интеины характеризуются рядом консервативных последовательностей, которые образуют семейство доменов, насчитывающее более 100 членов (см. базу данных в Интернете: www.neb.com/neb/inteins.html). Во время реализации стандартного механизма белкового сплайсинга на первом этапе происходит ацильный перенос N —> S или N —> О, при котором N-концевой экстеин переносится на SH- или ОН-группу боковых цепей остатков Cys/Ser интеина, расположенных вблизи его N-конца (рис. 39). Образовавшийся в итоге разветвленный интермедиат далее разрешается в реакции циклизации с участием остатка Asn в С-концевой части интеина, который таким образом вырезается в виде С-концевого сукцинимид-ного производного. Эта реакция частично катализируется интеи-ном, обладающим специфической пространственной структурой, благодаря которой расщепляемая амидная связь приобретает конформацию с высокой энергией. На заключительном этапе сплайсинга в результате S —> N или О —> N переноса ацила образуется амидная связь между двумя экстеинами процессируемой полипептидной цепи, что напоминает механизм химического лигирования незащищенных пептидов, рассмотренный выше.
Несмотря на то, что биологическое значение сплайсинга белков до сих пор остается невыясненным, сам он уже находит применение в биотехнологии. Имеются, по крайней мере, две области применения интеинов. При одном подходе используют мутантные формы интеинов, у которых произведена замена Asn —> Ala в С-концевой части, что делает возможным прохождение только первого этапа сплайсинга. В таких системах рекомбинантные белки, синтезируемые в виде гибридных полипептидов с модифицированным интеином, отщепляются с участием тиольной группы в результате внутримолекулярной реакции трансэтерифика-ции (рис. 40). В итоге происходит высокоспецифическое протео-литическое освобождение рекомбинантного белка от предшественника, что облегчает его последующую очистку. Причем в процессе такого освобождения могут быть получены а-тиоэфир-
Предыдущая << 1 .. 123 124 125 126 127 128 < 129 > 130 131 132 133 134 135 .. 221 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed