Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Меньшие значения рКа а-аминогрупп в белках по сравнению с 8-аминогруппами остатков Lys позволяют осуществлять специфическое аминоацилирование N-концов полипептидов при умеренно кислых значениях pH реакционной смеси [49]. С использованием другого химико-ферментативного подхода также удается вводить в белки сайт-специфическую метку [50]. В этом случае на первом этапе с помощью протеинкиназы и аналога [ATPj-y-S осуществляют специфическое присоединение к полипептидной цепи тиофосфатной группы, которую далее S-алкилируют флуоресцирующим зондом. Таким способом была получена, в частности, меченая протеинкиназа А [51].
При другом общем подходе полусинтеза белков используют протеолитические ферменты для лигирования пептидов. В этом случае для обращения протеолитической реакции условия реакции изменяют таким образом, что аминолиз промежуточного пептидил-ферментного комплекса становится предпочтительнее его гидролитического расщепления. Необходимые условия создаются путем включения в реакционную смесь органических растворителей, таких как глицерин, диметилформамид или ацетонитрил. При наличии в реакционной смеси второго пептида в процессе аминолиза происходит его объединение с пептидом из комплекса посредством амидной связи [52,53]. Обратный проте-олиз был успешно использован для лигирования пептидов с папа-ином, трипсином и субтилизином. С использованием такого рода
подходов путем последовательного ферментативного лигирования олигосахаридов и полипептидов удается получать специфически гликозилированные производные белков, например, гли-козилированную рибонуклеазу В [54].
Путем изменения активных центров протеолитических ферментов с помощью генно-инженерных методов удалось значительно улучшить их способность лигировать пептиды. В частности, Д. Джексон с соавт. в 1994 г. получили двойной мутант суб-тилизина, названный субтилигазой, обладающий высокой проте-инлигазной активностью [55]. Замена Ser —> Cys в активном центре фермента придавала ему способность ацилироваться пептидами, этерифицированными по С-концу гликолат-фенилаланил-амидной группой. Вторая замена Pro —> Ala в том же активном центре компенсировала негативные стерические эффекты первой мутации и усиливала аминолиз промежуточного тиоэфирно-го комплекса фермент-пептид N-концевой аминогруппой второго пептида, сопровождаемый объединением этих двух пептидов с помощью пептидной связи. Субтилигаза была успешно использована для полного синтеза нескольких белков и получения циклических пептидов. В частности, с ее помощью удалось осуществить синтез нативной рибонуклеазы, что будет подробнее рассмотрено ниже [55].
Д. Джексоном с соавтор, была разработана стратегия синтеза крупных полипептидных цепей с использованием субтилига-зы, реализованная в синтезе модифицированной рибонуклеазы А, обладающей ферментативной активностью [55]. На первом этапе синтеза был получен полностью незащищенный пептид, представляющий собой С-концевой фрагмент РНКазы А, который был использован в дальнейшем в качестве акцепторной молекулы (см. схему).
Следующий N-концевой донорный фрагмент полипептидной цепи этерифицирован по С-концу гликолат-фенилаланиламидом (glc-F-NH2). Полученный эфир эффективно ацилируется субтилигазой, что отражает особенности ее субстратной специфичности: фермент предпочитает использовать в качестве субстрата эфиры, в которых освобождается группа glc-F-NH2. В отличие от этого донорный пептид содержит на N-конце дополнительную изоникотиноильную защитную группу, что предотвращает его лигирование самого на себя. Такая группа вводится на последней стадии твердофазного синтеза пептидов и проявляет устойчивость к разбавленной плавиковой кислоте (HF), которая использовалась для снятия защиты с боковых цепей пептидов и отщепления самих пептидов от твердого носителя. После каждого ли-
гирования пептидов изоникотиноильную группу удаляли в условиях мягкого восстановления (в присутствии цинка и уксусной кислоты) для освобождения ЫН2-группы - необходимой участницы очередного цикла лигирования.
Исходя из субстратной специфичности субтилигазы (фермент эффективно использует крупные гидрофобные донорные субстраты и малоэффективен с отрицательно заряженными
R-NH-nenTHfly-CO-R + ^И-пептидг-СООН
J 1. Субтилигаза
R-NH-nenTHflY-CO-NH-nenTHflz-COOH
| 2. Z11/CH3COOH
НгИ-пептиду-СО-ЫН-пептидх-СООН
R-NH-nenTHflx-CO-R J 3. Повторение этапов 1 и 2
НгИ-пептидх-СО-ЫН-пептиду-СО-ЫН-пептид^-СООН
О О
Изоникотиноил Гликолат-фенилаланиламид
X, Y, Z - различные пептиды (glc-F-NH^;
остатками аминокислот или остатками Pro, попадающими в его активный центр), карту полипептидной цепи РНКазы А разделили на шесть фрагментов. Эти фрагменты были синтезированы и лигированы друг с другом в соответствии с вышеприведенной схемой с выходом, достигающим 70% на каждом этапе. В
результате была получена полноразмерная полипептидная цепь РНКазы А (124 аминокислотных остатка), которая после спонтанного фолдинга приобрела искомую ферментативную активность. В ходе синтеза отдельных пептидов исследователи заменили два остатка His, находящихся в активном центре фермента (положения 12 и 119), на остатки 4-фторгистидина. Поскольку это производное His обладаетрКа = 3,5 (рКа His = 6,8), у искусственной РНКазы А наблюдался резкий сдвиг в оптимуме pH реакции гидролиза субстрата без заметных изменений &кат, что было особенно неожиданным результатом, позволившим сделать интересные выводы о механизме ферментативной реакции, осуществляемой РНКазой А. Позднее субтилигаза была успешно использована для синтеза модифицированного гормона роста человека.
