Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
ными генно-инженерными методами, а соответствующим образом аминоацилированные супрессорные тРНК обеспечивали считывание таких кодонов во время трансляции мРНК.
В настоящее время существуют, по крайней мере, три метода, которые позволяют осуществлять аминоацилирование тРНК неприродными остатками аминокислот. Во-первых, возможно проводить химическое аминоацилирование супрессорных тРНК соответствующими аналогами аминокислот. В этом случае требуемым аналогом ацилируют олигонуклеотид pdCpA, который затем лигируют с укороченной соответствующим образом тРНК. Во-вторых, как уже упоминалось выше, существуют подходы, позволяющие модифицировать аминокислотные остатки непосредственно в составе аминоацилированных тРНК [34, 35]. В-третьих, ошибочное аминоацилирование аналогами можно осуществлять и с помощью самих нативных аминоацил-тРНК-синте-таз, не оставляя им выбора в подходящей аминокислоте. К сожалению, этот метод ограничен лишь небольшим числом аналогов аминокислот, которые аминоацил-тРНК-синтетазы способны использовать в качестве субстратов. К таким аналогам, в частности, относятся фтортирозин [36] и тиопролин [37]. В то же время химическое аминоацилирование тРНК является универсальным средством решения данной проблемы.
Использование избыточных кодонов для осуществления сайт-специфического замещения неприродными аминокислотами. Основная трудность, с которой столкнулись исследователи при использовании бессмысленных кодонов для включения аналогов аминокислот в белки, была преждевременная термина-ция трансляции, происходящая из-за частого гидролиза пепти-дилтРНК релизинг-факторами трансляции, распознающими стоп-кодоны. Это сопровождалось освобождением недостроенного полипептида после включения аналога в строящуюся поли-пептидную цепь. Для решения такой проблемы были разработаны системы трансляции из Micrococcus luteus. У этого микроорганизма имеются шесть кодонов, совершенно не задействованных в синтезе белка, и именно их использовали для включения неприродных аминокислотных остатков в полипептидные цепи [38]. В частности, избыточный кодон AGA, обычно кодирующий Arg, был включен в последовательности генов, и такая ДНК была применена в качестве матрицы в бесклеточной системе трансляции, сопряженной с транскрипцией. При наличии соответствующей аминоацил-тРНК в реакционной смеси происходит включение аминокислотного остатка в полипептидную цепь, а в ее отсутствие - терминация трансляции. Это явилось основой для со-
здания систем SNAAR, не зависимых от наличия в транслируемых мРНК стоп-кодонов и супрессорных тРНК.
При другом подходе повышение эффективности супрессии бессмысленных кодонов достигается применением специфичес-
— DKo
ких природных супрессорных тРНК [39]. Дрожжевая тРНКсис,
чаще всего используемая для супрессии амбер-кодонов, обеспечивает низкую эффективность супрессии (особенно путем включения в полипептидные цепи полярных аминокислот), что приводит к очень низкому выходу соответствующего белкового продукта. Более высокой эффективностью in vitro обладают супрессорные tPHK^ua и tPHK^ua Е. coli, причем последняя оказалась наиболее эффективной, так как с одинаковым успехом направляет включение в белки как полярных, так и неполярных аминокислотных остатков.
Большинство разновидностей методов SNAAR реализуется с использованием бесклеточных систем трансляции, сопряженных с транскрипцией (см. раздел 6.3 в первой части книги). В оптимизированных бесклеточных системах удается синтезировать на матрице рекомбинантной ДНК до 0,4 мг белка, содержащего измененные аминокислотные остатки, в 1 мл бесклеточного экстракта. Кроме того разработаны соответствующие системы SNAAR, функционирующие in vivo, в частности в ооцитах X. 1ае-vis. В этом случае модифицированные аминоацилированные тРНК вводят в ооциты с помощью микроинъекций [40]. Хотя такая система непригодна для крупномасштабной наработки модифицированных белков, в ней удается получать белки, прошедшие посттрансляционные модификации, что невозможно осуществить в аналогичных бесклеточных системах.
Альтернативой микроинъекциям при создании модифицированных белков методом SNAAR in vivo является разработка специфических пар тРНК : аминоацил-тРНК-синтетаза, в которых фермент проявляет высокую специфичность к конкретному аналогу аминокислоты и лишь его использует для аминоаци-лирования тРНК [41]. Для получения соответствующих ферментов может быть использован весь арсенал методов белковой инженерии.
В некоторых особых случаях удается включать неприродные аминокислотные остатки в белки in vivo, не прибегая к генно-инженерным манипуляциям. В частности, можно встраивать и-фторфенилаланин (p-F-Phe) в специфическое положение полипептидной цепи дигидрофолатредуктазы в клетках специального штамма Е. coli, содержащего мутантную аминоацил-тРНК-синте-
тазу для TPHKPhe, которая утратила способность взаимодействовать активным центром с p-F-Phe, токсичным для клеток. Для направляемого амбер-кодоном включения p-F-Phe в соответствующее место полипептидной цепи дигидрофолатредуктазы в бактериальные клетки вводили генно-инженерную конструкцию, обеспечивающую экспрессию дрожжевой супрессорной
