Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
1.2.1. Получение делеций и вставок
Делецией называют потерю части нуклеотидов в геноме организма. Такой вид мутаций удобнее всего использовать для локализации (картирования) функционально значимых участков в генах и кодируемых этими генами белках. Действительно, последовательное удаление все новых и новых участков ДНК на границах генов с помощью делеций оказалось исключительно плодотворным в обнаружении регуляторных элементов генов, исследовании их структурно-функциональных особенностей, взаимного расположения и влияния друг на друга. В то же время укорочение поли-пептидных цепей белков путем введения делеций в их гены дает возможность получать мини-белки и мини-ферменты для струк-турно-функциональных исследований и биотехнологии. Простой и эффективный метод создания делеций любого размера разработан с использованием экзонуклеазы Bal31 [15]. Метод позволяет удалять нуклеотиды в окрестностях сайтов рестрикции (рис. 32).
Ген, клонированный в плазмиде, расщепляют по уникальному сайту рестрикции и образовавшиеся линейные молекулы ДНК инкубируют в присутствии экзонуклеазы Bal3\. При этом экзонуклеаза последовательно удаляет нуклеотиды с обоих концов ДНК, причем количество удаляемых нуклеотидов прямо пропорционально времени инкубации ДНК с нуклеазой, а также зависит от температуры инкубации и концентрации фермента. В результате подобного действия образуется набор фрагментов ДНК разной длины, содержащих делеции различных размеров по обе стороны выбранного сайта рестрикции. К “тупым” концам Таких молекул ДНК с помощью ДНК-лигазы присоединяют Двухцепочечные олигонуклеотидные линкеры, содержащие уникальный (часто исходный) сайт рестрикции, обрабатывают соответствующей рестриктазой, замыкают молекулы в кольцо посредством лигирования и затем вводят их в бактериальные клетки. Точное картирование концов делеций осуществляют секвени-рованием соответствующих участков ДНК мутантных плазмид. В результате получают набор делеций разного размера, положе-
ВатШ
Расщепление с помощью ZscoRI ВатШ ВатШ
Экзонуклеаза Ва131 (3' - и 5' - экзонуклеазы)
Ш/////Ж
---......---шт
Увеличение
времени
расщепления
| BamHI-линкеры
ВатШ + ДНК-лигаза замыкание в кольцо
?coRI
Ююны с делециями
ВатШ
ВатШ
ВатШ
ВатШ
Рис. 32. Получение делеций с помощью нуклеазы Ва1Ъ\
ние которых в исследуемом фрагменте ДНК строго локализовано. Нуклеаза Ва1Ъ\ является сложноустроенным ферментом и имеет склонность к асинхронному расщеплению двухцепочечных молекул ДНК, что сопровождается образованием делеций разного размера. В отличие от этого процессивно функционирующая экзонуклеаза III дает возможность получать более гомогенный набор делеций.
Экзонуклеаза III позволяет не только создавать двунаправленные делеции, но и однонаправленно удалять последовательности ДНК по соседству с выбранным сайтом рестрикции. В последнем случае участок ДНК, в котором необходимо получить делецию, расщепляют двумя рестриктазами, одна из которых создает “тупой” или 5'-выступающий конец вблизи делетируемого сегмента ДНК, а другая - четырехнуклеотидный 3'-выступающий участок. Однонаправленность действия экзонуклеазы III обеспечивается ее специфичностью, поскольку она может начинать гидролиз ДНК только с “тупого” или 3'-утопленного конца. Возникающие в итоге одноцепочечные участки далее удаляются нуклеазами 51 (или mung bean), а в случае необходимости к образовавшимся “тупым” концам присоединяют линкеры для дальнейшего клонирования модифицированного фрагмента.
Небольшие делеции в окрестностях сайтов рестрикции можно получать быстрее удалением “липких” концов линеаризованной плазмидной ДНК после рестрикции с последующим замыканием линейной ДНК в кольцо лигированием по образовавшимся “тупым” концам. В этом случае размер делеции соответствует размеру одноцепочечных “липких” концов в сайтах рестрикции. Кроме того, такой метод допускает простую проверку наличия мутаций в требуемом участке ДНК, так как в результате мутации происходит потеря уникального сайта рестрикции. Для получения вставок коротких или протяженных последовательностей нуклеотидов в исследуемые участки клонируемых генов также разработаны эффективные и надежные методы. В простейшем случае такая задача решается путем расщепления исследуемого гена рестриктазой по уникальному сайту рестрикции и встраивания по этому сайту фрагмента природной ДНК или синтетического двухцепочечного олигонуклеотида, который фланкирован соответствующими “липкими” концами. Лигирование может проводиться и по “тупым” концам. В таком случае последовательности нуклеотидов на концах вставки уже не имеют существенного значения для встраивания этого фрагмента по сайту рестрикции.
Для создания множественных вставок коротких или протяженных последовательностей нуклеотидов в исследуемых участ-
ках ДНК в основном используют два подхода. В первом случае с помощью панкреатической ДНКазы в низких концентрациях в присутствии ионов Мп2+ вносят случайным образом один двухцепочечный разрыв в каждую векторную плазмиду, содержащую клонированный ген. К концам образовавшихся линейных молекул ДНК присоединяют с помощью ДНК-лигазы синтетические олигонуклеотидные линкеры, содержащие сайт рестрикции, который отсутствует в исследуемой плазмиде. Образовавшиеся линейные молекулы ДНК с линкерами обрабатывают рестриктазой, узнающей сайт рестрикции линкера, что приводит к образованию липких концов, и замыкают в кольцо с помощью ДНК-лигазы. В итоге кольцевые молекулы ДНК содержат исследуемый клонированный ген, в котором имеется по одной вставке локализованных случайным образом (в соответствии с расположением исходных двухцепочечных разрывов) олигонуклеотидных линкеров. Во втором случае статистические разрывы в двухцепочечной ДНК получают путем частичного (неполного) гидролиза мелкощепящими рестриктазами, которые узнают сайт рестрикции длиной в четыре нуклеотида. Метод получения вставок с использованием синтетических олигонуклеотидных линкеров получил название сканирования линкером.
