Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Тот же принцип объединения двух фрагментов ДНК, перекрывающихся за счет праймеров, используется при получении делеций и вставок. Для создания делеции (на рис. 35,2 обозначена прямоугольниками на цепях ДНК) берут внутренние праймеры b и с, 5'-концы которых комплементарны матрице по одну сторону делетируемой последовательности нуклеотидов, а 3'-концы - последовательности нуклеотидов, фланкирующей другой ее конец. Образующиеся при этом продукты ПЦР АВ и CD перекрываются в точке делеции и далее используются как и в предыдущем случае. При получении вставок (см. рис. 35,3) применяют внутренние праймеры b и с, комплементарные друг другу своими 5'-концевыми частями, которые соответствуют образуемой олигонуклеотидной вставке во фрагмент матричной ДНК. 3'-Концы этих праймеров комплементарны участкам
Рис. 35. Использование ПЦР для получения мутаций
Получение точковых мутаций (/), делеций (2) и вставок (5): and- внешние праймеры, b и с - внутренние праймеры. АВ и CD - фрагменты ДНК, образовавшиеся в результате ПЦР с использованием праймеров а и Ь, а также с и d, соответственно. После гибридизации друг с другом объединяемых фрагментов ДНК сформировавшимися комплементарными последовательностями нуклеотидов одноцепочечные участки достраиваются ДНК-полимеразой в процессе ПЦР
СО | a + b b (2)
АВ
Делеции
I
b "•
АВ
1
CD
Вставки
ДНК-матрицы, непосредственно примыкающим к сайту, в который производится вставка олигонуклеотида.
С помощью метода ПЦР удается легко получать и множественные случайные мутации в конкретных участках ДНК. В этом случае в реакционной смеси искусственно создают условия, неоптимальные для точности функционирования термостабильной ДНК-полимеразы (подробнее см. раздел 2.2.2.).
1.2.4. Мегапраймеры в направленном мутагенезе
Недавно разработанные системы направленного мутагенеза с использованием ПЦР и мегапраймеров позволяют существенно облегчить процесс получения мутаций, что достигается отказом от использования перекрывающихся мутантных праймеров для синтеза мутантных фрагментов ДНК [25, 26]. Принцип этого метода заключается в следующем (рис. 36,а). В первом раунде ПЦР синтезируют мутантный фрагмент ДНК, в который вводят мутации с помощью одного из праймеров (праймер М). Поскольку образующийся продукт ПЦР обладает значительными размерами (его допустимые размеры 70-800 п.о.) и используется в качестве праймера в следующем раунде ПЦР, он получил название мегапраймера. Фрагмент очищают электрофорезом в агарозном геле и используют в качестве праймера во втором раунде репликации со встречным праймером А. Праймеры А и В могут быть универсальными и содержат на своих 5'-концах сайты рестрикции для дальнейшего клонирования фрагмента. Конечный продукт ПЦР, образовавшийся после второго раунда амплификации, длина которого может быть в пределах 400-2500 п.о., после очистки и инкубации с соответствующими рестриктазами клонируют в подготовленном векторе, заменяя исходный фрагмент ДНК на мутантный, полученный с использованием мегапраймера.
Имеется модифицированная методика, при которой во время ПЦР с мегапраймером не используется встречный праймер А, а в качестве праймеров функционируют обе цепи двухцепочечного ПЦР-продукта-мегапраймера (рис. 36,6) [27]. Метод позволяет получать как точковые мутации, так и делеции, вставки или замещения длиной до 25 п.о. В рассмотренном варианте метод с мегапраймерами предусматривает очистку промежуточных продуктов амплификации и последующие манипуляции с ними. Однако имеются его современные модификации, включающие ряд уже обсуждавшихся выше подходов, в частности, использование метилирования для освобождения от родительской ДНК, которые в комбинации позволяют получать мутантный ген в одной пробирке [27].
з
Матрица
1. ПЦР с праймерами В и M
2. Очищенный продукт
Мегапраймер
ПЦР с праймером А и мегапраймером
Мегапраймер
Рис. 36. Направленный мутагенез с использованием мегапраймеров [26 (а) и 27 (6)]
а - многоступенчатый вариант метода. Первый раунд ПЦР проводят на плазмиде с мутагенизирующим праймером М и встречным - В; после очистки продукт ПЦР, содержащий требуемые мутации, в свою очередь, используют в качестве праймера (мегапраймера) со встречным праймером А; итоговый продукт ПЦР содержит на своих концах уникальные сайты рестрикции, введенные с помощью праймеров А и В, что позволяет далее клонировать всю конструкцию;
б - мутагенез в одной пробирке. В первой фазе реакции (A-В) в стандартных условиях на матрице плазмидной ДНК, полностью метилированной по сайту Dpnl, синтезируют короткий продукт ПЦР с использованием двух мутагени-зирующих праймеров (1 и 2) или пары, включающей мутагенизирующий (2) и встречный универсальный (3) праймеры; во второй фазе мутагенеза температуру отжига в циклах повышают, что исключает участие в ПЦР коротких праймеров (1-3), а их роль берут на себя обе цепи мегапраймера (С-Е); образовавшийся продукт ПЦР инкубируют с рестриктазой Dpnl с целью удаления родительской ДНК и реакционной смесью без очистки трансформируют клетки В. coli’, для замещения участка гомологичной последовательности в исследуемом родственном гене на последовательность мегапраймера последний после синтеза (этапы A-В) очищают и используют в ПЦР с плазмидным вектором, содержащим соответствующий рекомбинантный ген (этапы G-I); точки обозначают мутации; выделены модифицируемые участки плазмид
