Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
По оси z на рисунке отражен уровень функциональности конкретных молекул пространства последовательностей, выраженный в произвольных единицах, который в случае ферментов количественно характеризует их способность осуществлять химическую реакцию (например, число оборотов &кат или коэффициент специфичности kKaT/KM данного фермента). Введение третьего измерения позволяет получать т.н. ландшафты функциональности (fitness landscapes), на которых холмы, в том числе и их склоны, графически представляют функциональности отдельных макромолекул, причем отдельные холмы соответствуют разным функциям белков анализируемого пространства последовательностей. Вершины холмов занимают макромолекулы с максимальной функциональностью (в случае ферментов - удельной активностью, специфичностью, стабильностью и тому подобными свойствами, важными для их функционирования в определенных услови-
О''о
Индивидуальные последовательности
Рис. 31. Ландшафт функциональности среди пространства последовательностей белковых молекул [13]
Каждая точка на плоскости отражает индивидуальную последовательность полипептидной цепи заданной длины, а все вместе - всевозможные последовательности, собранные из данного количества аминокислотных остатков, которые составляют полное пространство последовательностей для полипептида определенного размера; функциональность - количественно выраженная (в произвольных единицах) способность конкретного белка из данного пространства последовательностей выполнять конкретную функцию, например, с некоторым сродством связывать лиганд
ях). Природные последовательности, обнаруженные в живых организмах, составляют отдельную немногочисленную группу общего пространства, тогда как его оставшаяся часть относится к другим теоретически возможным последовательностям. Белковая инженерия позволяет создавать и исследовать последовательности белков, не встречающиеся в природе и обладающие совершенно новыми биохимическими свойствами, что неуклонно приводит к Изменению ландшафта, характерного для конкретного пространства последовательностей. При этом необходимо иметь в виду, что Такие статические ландшафты лишь частично отражают свойства пространства последовательностей, поскольку и само пространство, и уровни функциональности составляющих его членов могут Непрерывно изменяться, особенно в ходе направленной эволюции
белков, не говоря уже о сложных, эволюционирующих биологических системах [14].
Создание методами рационального редизайна искусственных белков, обладающих совершенно новыми функциями, на основе по-липептидного скелета биологически инертных макромолекул, как правило, требует введения нескольких мутантных аминокислотных остатков в разные участки их полипептидных цепей, так как одиночные мутации не приводят к желаемому результату. Говоря о возможностях метода в терминах ландшафтов функциональности, можно предположить, что введение множественных мутаций позволяет пересекать биологически инертные пространства последовательностей и попадать в зоны новых холмов, на их склоны. Это открывает путь для дальнейшего совершенствования функциональности нового белка, полученного методами белковой инженерии, и может приводить к изменению вида самого ландшафта.
Для реализации замысла по созданию новой белковой молекулы имеется несколько экспериментальных путей, в том числе и химический синтез полипептидных цепей. Однако наиболее популярным подходом к получению совершенно новых, а также измененных природных белков, является их биосинтез in vivo или in vitro. В этом случае создают ген исследуемого белка, клонируют его в экспрессирующем векторе и далее осуществляют транскрипцию гена с последующей трансляцией образовавшихся мРНК. Замены аминокислотных остатков в исследуемом белке проводят целенаправленно, создавая мутации в определенных участках рекомбинантного гена, т.е. осуществляя процесс направленного мутагенеза.
1.2. Методы направленного мутагенеза
Развитие генной инженерии облегчило процесс получения мутаций в конкретных участках генома и анализ последствий этих мутаций на молекулярном уровне. Совокупность методов получения конкретных мутаций на основе генно-инженерных подходов называют направленным, или сайт-специфическим мутагенезом. Прообразом направленного мутагенеза является простая инкубация клонированного гена с химическими мутагенами in vitro, которая приводит к четкой локализации возникающих мутаций в пределах этого гена. В настоящее время разработано много эффективных методов сайт-специфического мутагенеза, позволяющих сознательно производить мутационные замены конкретных нуклеотидов. Получение заранее определенных му-таций в сегментах рекомбинантных генов, введение мутантных
генов в организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена - этот подход прямо противоположен классическим методам получения мутаций путем отбора спонтанно возникающих мутантов, а также обработкой целых организмов или их репродуктивных органов мутагенами. Сумма подобных подходов к исследованию функций генов получила название обратной генетики.
