Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 123

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 117 118 119 120 121 122 < 123 > 124 125 126 127 128 129 .. 221 >> Следующая

1. Инкубация с Dpn\
2. Очистка в геле
3. Лигирование Фосфорилирование Dam-метилирование
4. Очистка ДНК
Следующий цикл ПЦР-мутагенеза
достройки дочерних цепей ДНК-полимеразой с использованием мутагенизирующих олигонуклеотидов в качестве праймеров, родительские полностью метилированные молекулы избирательно разрушают рестриктазой Dpnl в условиях высокой ионной силы, благодаря которой метилированные наполовину дочерние ДНК остаются интактными. Дальнейшее повышение эффективности этого метода достигается сочетанием метилирования исходных ДНК и введения урацила вместо тимина или использованием второго олигонуклеотида, изменяющего селектируемый сайт рестрикции, как было описано выше.
В сочетании с ПЦР метод элиминации метилированных молекул ДНК рестриктазой Dpnl позволяет направленно вводить множественные мутации, избегая необходимости трансформации бактериальных клеток и выделения плазмидной ДНК на промежуточных стадиях. При таком подходе исходную мутагенизируе-мую плазмидную ДНК (3-5 т.п.о.) полностью метилируют Dam-метилтрансферазой in vitro и используют в качестве матрицы при ПЦР с двумя перекрывающимися мутантными праймерами (рис. 34). После завершения ПЦР, в результате которой амплифи-цируется вся молекула исходной плазмидной ДНК, продукт ПЦР полностью неметилирован. Это позволяет удалить исходную (немутантную) метилированную матричную ДНК с помощью рест-риктазы Dpnl, и после ликвидации одноцепочечных разрывов с помощью ДНК-лигазы полученный продукт ПЦР, содержащий первую мутацию, после электрофоретической очистки используют в качестве матрицы в новом раунде ПЦР со второй парой мутантных праймеров для введения другой мутации по той же схеме. Общее количество таких циклов мутагенеза in vitro определяется количеством мутаций, которые необходимо ввести в исходную молекулу плазмидной ДНК. На заключительном этапе сконструированную таким образом мутантную ДНК вводят с помощью трансформации в компетентные бактериальные клетки и мутантную плазмидную ДНК получают в препаративном количестве. Эти принципы легли в основу коммерчески доступной и одной из наиболее широко используемых в настоящее время систем направленного мутагенеза “QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis System (QCM)”, разработанной фирмой Stratagene (США).
1.2.3. ПЦР с перекрывающимися праймерами
Разработка метода полимеразной цепной реакции принципиально изменила ситуацию в исследованиях по направленному мутагенезу. Использование ПЦР для направленного мутагенеза ос-
новано на применении в качестве праймеров олигонуклеотидов, не полностью комплементарных матричной ДНК. Повышенные требования к комплементарности накладываются лишь на последний, 3'-концевой, нуклеотид праймера, но, даже в случае 3'-концевой некомплементарности, праймеры часто продолжают функционировать в системе ПЦР, хотя и с разной эффективностью. В то же время некоторая способность 17-нуклеотидного праймера инициировать ПЦР проявляется даже при наличии всего восьми нуклеотидов, комплементарных матрице, три из которых расположены на его 3'-конце. Таким образом, простейшим способом введения сайт-специфических мутаций в амплифициру-емый фрагмент ДНК является использование праймеров, частично комплементарных матрице, т.е. содержащих необходимые мутантные нуклеотиды. Этот способ применяется для создания в амплифицируемом продукте новых сайтов рестрикции с целью его последующего клонирования. Такой подход удобен для встраивания амплифицируемого продукта в экспрессирующий вектор в одной открытой рамке считывания (ОРС) с инициирующим ATG-кодоном вектора. Действительно, как уже обсуждалось в первой части книги, экспрессирующие векторы часто содержат 5'-концевую часть будущего рекомбинантного гена, включая регуляторные последовательности, промотор, ATG-ko-дон и иногда дополнительные кодоны нескольких последующих аминокислот. При конструировании таких векторов в последовательности, следующие за ATG-кодоном, вводят сайты рестрикции, по которым и встраивают фрагмент экспрессируемого гена, кодоны которого (для полноценной экспрессии гена) должны находиться в одной ОРС с ATG-кодоном вектора. Положение природных сайтов рестрикции в клонируемом гене редко отвечает требованиям ОРС вектора. Поэтому введение искусственных сайтов рестрикции в клонируемый фрагмент с помощью праймеров, не полностью комплементарных матрице, является хорошим решением проблемы.
Вырожденные праймеры, которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов, содержащих многие точко-вые мутации, также используют для сканирования определенных участков ДНК [23]. В таком классическом варианте постановки ПЦР, кроме точковых мутаций, можно легко получать делеции и вставки. Дальнейшим усовершенствованием метода направленного мутагенеза с помощью ПЦР явилась разработка подхода к созданию гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеров [24] (рис. 35). Этот метод позволяет не только целенаправленно получать точковые мутации, делеции и встав-
ки, но и гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лига-зы. Для получения точковых мутаций используют пару праймеров, в которых изменены соответствующий нуклеотид или небольшая группа нуклеотидов (мутантный сайт обозначен на рис. 35,7 прямоугольниками внутри праймеров). При этом внутренние праймеры b и с комплементарны друг другу. В первых ПЦР в отдельных пробирках амплифицируют правую и левую части мутагенизируемого сегмента ДНК с использованием пар праймеров а + b и с + d, что приводит к образованию двух фрагментов ДНК, перекрывающихся на участках, которые содержат включенные праймеры (этапы 7 и 2). Фрагменты очищают от праймеров, смешивают друг с другом в эквимолярном соотношении и после цикла тепловой денатурации и ренатурации используют в качестве матрицы в другой ПЦР с внешними праймерами and (этап 3). На этом этапе в первом цикле ПЦР происходит достройка цепей перекрывающихся фрагментов ДНК (пунктирные линии на рис. 35,7), и образовавшийся фрагмент двухцепочечной ДНК, содержащий требуемую мутацию, далее служит матрицей для амплификации и по завершении ПЦР присутствует в реакционной смеси в препаративном количестве.
Предыдущая << 1 .. 117 118 119 120 121 122 < 123 > 124 125 126 127 128 129 .. 221 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed