Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
1.2.2. Мутагенез с использованием олигонуклеотидов
Благодаря своей высокой эффективности и простоте направленное введение мутаций с использованием олигонуклеотидов по модифицированной методике Т.А. Кункеля до сих пор находит широкое применение [16, 17]. В этом подходе для направленного введения мутаций используют 20-25-звенный олигонуклеотид, комплементарный мутагенизируемому участку гена, который содержит все требуемые замены нуклеотидов. Мутагенизируемый ген или его участок клонируют в фагмидном векторе, в котором далее стандартными методами заменяют ряд остатков тимина на остатки уридина и переводят в одноцепочечную форму. Олигонуклеотид гибридизуют с такой кольцевой одноцепочечной ДНК и используют в качестве праймера для модифицированной Т7-ДНК-полимеразы (секвеназы), с помощью которой в присутствии обычных четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов синтезируют комплементарную цепь ДНК (рис. 33).
Остающийся одноцепочечный разрыв лигируют и образовавшиеся двухцепочечные кольцевые ковалентно замкнутые молекулы ДНК инкубируют с урацил-ДНК-гликозилазой. При этом удаляются остатки урацила из матричной цепи ДНК с образова-
ло
5. Репликация
1. Отжиг мутантного праймера
Мутантный праймер
----К------
4. Трансформация Е. coli ung*
Рис. 33. Схема направленного мутагенеза по методу Т.А. Кункеля [17].
Праймер, содержащий мутантный нуклеотид (помечен крестиком), отжигают с одноцепочечной ДНК (/), в которой большая часть остатков Т была предварительно заменена на U; после синтеза второй цепи ДНК-полимеразой и лигирования одноцепочечного разрыва (2) остатки U в дочерней цепи удаляют с помощью урацил-ДНК-гликозилазы (UDG) (3) и модифицированную ДНК вводят в клетки Е. coli, содержащие нативный ген UDG - ung+ (4), в которых происходит деградация дочерней цепи и построение новой цепи (5), содержащей мутантный нуклеотид в требуемом положении. оцДНК - одноцепочечная ДНК
нием апиримидиновых сайтов, в которых спонтанно в условиях щелочных значений pH возникают одноцепочечные разрывы ДНК. Это сопровождается эффективной элиминацией исходной цепи ДНК, не содержащей мутаций, а следовательно, предотвращает возможность репарации введенных мутаций и восстановления исходной первичной структуры мутагенизируемого участка. Такими синтезированными in vitro молекулами ДНК далее трансформируют компетентные клетки Е. coli, содержащие функциональный ген урацил-ДНК-гликозилазы (ung), что способствует дальнейшему удалению остатков урацила в родительской цепи ДНК и повышению эффективности мутагенеза. На этом этапе также происходят достройка второй цепи плазмидной ДНК и фиксация мутаций, вводимых с помощью мутантного олигонуклеотида. К достоинствам метода следует отнести его простоту: все основные реакции по подготовке ДНК к трансформации проводят в одной пробирке, использование секвеназы позволяет быстро и эффективно достраивать цепь ДНК. Эффективность ме-
тода достигает 80%, т.е. только один из пяти полученных клонов не содержит требуемых мутаций.
Имеются варианты метода, которые позволяют избегать использования ДНК с модифицированными остатками урацила и всех последующих манипуляций, связанных с отбором мутантных плазмид [18, 19]. В этом случае после денатурации двухцепочечной плазмидной ДНК щелочью мутагенизируемую цепь гиб-ридизуют одновременно с двумя олигонуклеотидами, из которых первый содержит требуемые мутации, а второй вносит мутации в ген (3-лактамазы, используемой в качестве селектируемого маркера. Получаемая в результате мутантная (3-лактамаза, обеспечивает устойчивость трансформированных клеток к смеси антибиотиков: ампициллина, цефотаксима и цефтриаксона, чего не происходит при наличии в клетках исходного вектора. Таким образом, приобретение клетками устойчивости к смеси антибиотиков с высокой вероятностью свидетельствует об одновременном присутствии в векторе с клонированным мутагенизируемым геном требуемых мутаций.
Еще одним широко распространенным способом отбора молекул ДНК - потомков мутантной цепи плазмидной ДНК является расщепление двухцепочечных молекул плазмидной ДНК, полученных на матрице родительской немутантной цепи, по уникальному сайту рестрикции, который элиминируется в мутантной цепи вторым олигонуклеотидом [20]. Этапы реализации этого подхода в общих чертах совпадают с вышеописанными для (3-лактамазы.
Эффективным способом освобождения от исходных немутантных молекул ДНК может быть использование рестриктаз, действие которых зависит от метилирования сайтов рестрикции [21, 22]. При таком подходе работу по введению мутаций с помощью олигонуклеотидов начинают на плазмидной ДНК, сайты рестрикции на которой для этих рестриктаз, в частности Dpnl, полностью метилированы Dam-метилтрансферазой in vitro. После
-------
Рис. 34. Схема направленного мутагенеза с использованием ПЦР и рес-триктазы Dpnl [22]
Мутагенизируемую ДНК полностью метилируют Dam-метилазой и используют в качестве матрицы в ПЦР с праймерами, содержащими требуемую мутацию (помечена); по завершению ПЦР, в которой образуется неметилиро-ванная ДНК, родительскую ДНК убирают с помощью рестриктазы (/), а продукт ПЦР очищают электрофорезом (2); после фосфорилирования концов ДНК в одноцепочечных разрывах и их лигирования, метилирования (3) и освобождения от неполностью метилированных молекул с помощью рестриктазы (4) проводят ПЦР с новыми мутагенизирующими праймерами
