Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
N -> S-Перенос ацила
Транстиоэтерификация
1. Образование сукцинимида
2. S -> N-Перенос ацила
HS
H2N
NH
О
Рис. 39. Механизм сплайсинга белков [45]
Процесс состоит из серии переносов ацильных групп и внутренних реакций, катализируемых центральным доменом белка (интеином); сплайсинг завершается образованием обычной пептидной связи между двумя полипептидами (N- и С-экстеинами), фланкирующими интеин; N-экстеин - N-концевой экс-теин; С-экстеин - С-концевой экстеин
Белок
^¦о в
hrs
о
h2n
Интеиновый тиолиз R-SH
Бедок
VSR
о
Химическое лигирование нативных белков
Cys - Пептид |
Белок
—| Пептид
Полусинтетический продукт
Рис. 40. Освобождение целевого белка из рекомбинантного предшественника, содержащего интеин, и его спонтанное лигирование с другим пептидом по механизму EPL [45]
Мутационная замена Asn —> Ala в С-концевой части интеина блокирует последнюю стадию сплайсинга рекомбинантного белка (см. рис. 39), при конструировании которого нуклеотидная последовательность целевого белка 1 была объединена в коммерческом экспрессирующем векторе в одной рамке считывания с последовательностями нуклеотидов мутантного интеина и хитин-связыва-ющего домена (CBD) бактериальной хитиназы. Последний в рекомбинантном белке выполняет роль лиганда, взаимодействующего с иммобилизованным рецептором (хитином), что необходимо для очистки белка с помощью аффинной хроматографии; после связывания хроматографическим носителем целевой белок вырезается из полипептида с помощью добавленного тиола (R-HS) в реакции межмолекулярной трансэтерификации, и образовавшееся производное может быть далее лигировано с пептидом, содержащим остаток a-Cys. Таким образом, процесс EPL объединяет в себе две стадии: тиолиз с участием интеина и спонтанное химическое лигирование нативных белков
о
JL
NH
С-Экстеин
N-Экстеин
is 4
О
JL
NH
Объединение
фрагментов
NH
О
NH
С-Экстеин
Сплайсинг белка
NH
С-Экстеин
+
Рис. 41. Транс-сплайсинг белка с использованием разделенного интеина [45]
Полипептидную цепь интеина можно разделить на две части, N-концевую (IN) и С-концевую (Iе), которые сами по себе не обладают способностью осуществлять белковый сплайсинг, но после нековалентного объединения активируются
ные производные белков, которые являются ключевыми компонентами реакции нативного химического лигирования и далее могут быть непосредственно использованы в этой реакции для получения полусинтетических белковых продуктов [61-63].
Недавно несколькими независимыми группами исследователей была продемонстрирована возможность разделения интеинов на две части, каждая из которых сама по себе не обладает ферментативной активностью, однако после нековалентного их объединения комплекс активируется [64-67]. На основе этого открытия были разработаны высокоэффективные системы, осуществляющие транс-сплайсинг белков (рис. 41). При одновре-
менной экспрессии обеих частей интеина в одной клетке происходит спонтанный транс-сплайсинг белков, однако в бесклеточных системах для его прохождения необходимо проводить последовательно денатурацию и ренатурацию рекомбинантных белков. Недавно, у Synechocytis (Ssp) в белке DnaE был обнаружен составной интеин, который не требует для своей активации проведения цикла денатурации-ренатрурации [66]. Не исключено, что с его помощью удастся решить эту биотехнологическую проблему. С использованием транс-сплайсинга белков возможно получение полусинтетических белковых продуктов, объединяющих в себе рекомбинантный белок с полностью синтетическим пептидом, в который введена изотопная метка. Кроме того, недавно такой подход был применен для синтеза циклических пептидов [69], изучения белок-белковых взаимодействий [70] и осуществления контроля за функциями белков [71], что позволяет угадывать за ним большое будущее.
В заключение этого раздела следует упомянуть о возможности использования транс-сплайсинга белков для исследования белок-белковых взаимодействий в цитозоле прокариотических и эукариотических клеток [72, 73]. При таком подходе получают гибридные рекомбинантные белки путем слияния половинок зеленого флуоресцирующего белка (GFP) или люциферазы с двумя фрагментами расщепленного интеина. Другой конец одного из фрагментов интеина соединяют с белком-рецептором (приманкой), как это делается в классических системах дигибридного скрещивания у дрожжей, а у другого фрагмента - с большим количеством потенциальных белков-лигандов. В том случае, если между рецептором и лигандом происходит взаимодействие, два фрагмента интеинов объединяются друг с другом (см. выше, рис. 41) и осуществляют транс-сплайсинг, завершающийся образованием полноценного флуоресцирующего белка или люциферазы, что легко обнаруживается по изменению уровня флуоресценции инкубационной смеси.
