Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.
Скачать (прямая ссылка):
Б. Введение концевой метки в ДНК с помощью фрагмента Кленова
I. ДНК гидролизуйте соответствующей рестриктазой, дающей 5' выступающие концы. Смешайте.
введение метки в ДНК
17
25 мкл ДНК плазмиды 500 мкг/мл 18 мкл Н2<Э
5 мкл (х10) буфера для рестрикции (например, 500 idi 1«С1,
500 мМ трис-НС1 pH 8,0, 100 мМ MgCl2,20 мМ ДТТ)
2 мкл рестриктазы 40 ед. акт.
Реакцию проводите в течение I часа при 37°С.
2. Реакционную смесь охладите во льду и перенесите в пробирку, содержащую меченный 32Р дХТФ (50 мкКи) в виде сухого осадка.
3. Добавьте к смеси по 4 мкл 2,5 tdf растворов остальных немеченных дХТФ, комплементарных основаниям в выступающем конце.Добавьте 1-5 ел фрагмента Кленова .
4. Инкубируйте смесь 15 мин при комнатной температуре.
5. Добавьте к смеси 4 мкл 2,5 мМ раствора немеченного нук-леотидтрифосфата, по которому включалась метка и проводите инкубацию еще 5 мин.
6. Добавьте вторую рестриктазу в количестве, необходимом для полного гидролиза ДНК. Фрагмент Кленова можно не инактивировать.
7. Смесь инкубируйте I час при 37°С.
8. Добавьте 5 мкл 0,4 М ЭДТА, 15 мкл 70^ глицерина, содержащего 0,1% бромфенола и 10 мкл 10 х буфера для электрофореза (ЮхТБЕ).
9. Нанесите образцы на гель и проведите электрофорез.
введение метки в ДНК
18
Печение ДНК методом ник-трансляции
Меченные радиоактивные предшественники (дезоксинуклео-твдтрифосфаты) производства Ленинград (^н) и Ташкент ( 2Р) поставляются в 505S этаноле, поэтому перед реакцией их необходимо упаривать. В одной реакции обычно используется 10-20 мкКи. В случае ^2р достаточно одного предшественника. В случае желательно, чтобы все трифосфаты были меченные (это обусловлено удельной активностью препаратов). Для реакции достаточно 0,1-10 мкг ДНК. Коммерческие препараты ДНК-полимеразы I редко бывают свободными от эндонуклеаз, производящих ники в молекулах ДНК. Если же фермент свободен от примесей эндонуклеаз, то в реакционную смесь необходимо добавлять ДНКазу I. Оптимальное количество ДНКазы определяют эмпирически. Обычно используют 10 нг-I мкг/мл. Реакцию ведут в буфере следующего состава (хЮ):
10 х Ник буфер
100 мМ трис-НС1 pH 7.5 100 мМ MgCi2 I М Haci
50 мМ 2-меркапт оэтанол 13 мМ спермидин
0,1% тритон Х-100
Добавление в буфер спермидина и тритона позволяет метить препараты ДНК с примесями полисахаридов (при элюции из агорозных гелей).
I. В пробирку с высушенным радиоактивным предшественником добавьте:
I—10 мкл ДНК (1-3 мкг)
по I мкл трех остальных дХТФ I мМ
3 мкл 10 х ник буфера
3-5 ед.акт. ДНК-полимеразы I
I мкл ДНКазы I (100 нг/мл)
введение метки в ДНК
19
Н20 до 30 мкл
Реакцию проводите сначала при 37°С в течение 30 мин, затем при 18-22°С, 0,5-3 часа в зависимости от чистоты ДНК. (При инкубации меченной ДНК в этих условиях уменьшения ДЕ-связанного материала обычно не происходит.)
2. Для определения количества включившегося предшественника 0,5-1 мкл реакционной смеси нанесите на фильтр ДБ 81 диаметром 2,3 см (Whatman), Не включившиеся предшественники смывайте с фильтра 0,25 М К-фосфатным буфером pH 7,0. просчитайте в толуольном сцинтилляторе (эффективность счетами нуклеотидтрифосфатов, включившихся в ДНК, в 3 раза выше, чем у свободных), ^2Р - в сухом сцинтилляционном стакане (по Черенкову). В перво» случае фильтр необходимо тщательно высушить, во втором -
не обязательно. Эффективность счета не учитывайте, исходите из показаний счетчика. Обычно процент включения составляет: 32Р - 30-8056, для - 10-30?, удельная активность : для 32Р 5х 10^ -¦5х I07 срм/мкг, для -106-107 срм/мкг ДНК.
3. Остановите реакцию добавлением стоп-буфера (15? SDS, 20 мМ ЗДТА) и 50-100 мкг ДНК-носителя (озвученная ДНК из тимуса теленка или из спермы лосося ).
3JEKTP040FE3 ДНК
Для разделения фрагментов ДНК обычно используют агарозные или полиакриламидные гели. Наиболее распространенные буферные системы приведены в таблице I.
Таблица I
pH буфера может варьировать от 7,5 до 8,5, что практически не сказывается на качестве разделения.
А. Электрофорез в агарозных гелях
Агарозные гели, как правило, применяют для разделения ДНК размером более I т.п.н. В таблице 2 приведен диапазон эффективного разделения линейных молекул ДНК при различных концентрациях агарозного геля.
Таблица 2
буфер
состав концентрированного буфера
242 гр. трис 50 х 57,1 мл ледяная уксусная кислота
18,6 гр. ЭДТА
ТАЕ
108 гр. трис ТБЕ 10 х 55 гр. борная кислота
9,3 гр. ЭДТА
% геля
диапазон (т.п.н.)
60-5
20-1
0,3
0,6
электрофорез ДНК___________21
0,7 10-0,8
0,9 7-0,5
1,2 6-0,4
1,5 4-0,2
2,0 3-0,1
Эффективность разделения в агарозном геле не зависит от состава ДНК и температуры. Обычно электрофорез ведут при комнатной температуре. Большое значение имеет напряженность электрического поля, с увеличением которого понижается эффективность разделения. Для достижения максимальной эффективности разделения фрагментов ДНК напряженность не должна превышать 5 вольт на см геля.
