Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.
Скачать (прямая ссылка):
![](/pic/spacer.gif)
![](/pic/spacer.gif)
Примечание. Объем гибридизационного раствора должен соответствовать требованию полного погружения фильтров в ни». Концентрация зонда должна быть не меньше 0,5-1 пкМ/мл. При гибридизации нескольких фильтров в одной чашке Петри время гибридизации увеличьте в 2-3 раза. Не допускайте высыхания фильтров при гибридизации. Следите за тем, чтобы между фильтрами не было пузырей воздуха.
гибридизация на фильтрах_____________38
Гибридизация с протяженными ДНК-, FHK-зондами
1. Рассчитайте температуру и время гибридизации по следующим формулам:
Тг . 1,23 Тш „43,8
Тщ, = 81,5°С + 16,6 lgjNa+J + 0,41 (%G + С) -
- 0,61(% формамида)
Каждый процент негомологичности последовательности ДНК понижает на 1,5°С.
Время гибридизации должно соответствовать времени достижения (I *¦ 3)C0t1^,2 Количество часов, за которое достигается величина C^t.^ определяется по формуле:
1 Y Z
гДе х - количество добавленного зонда в мкг;
Y - сложность ДНК зонда, которая для большинства зондов пропорциональна длине зонда в единицах kb); Z - объем пробы в мл.
2. Положите фильтр на поверхность промывающего раствора (50 мМ трис-НС1, pH 8,0, 1 М ЫаС1, 1 мМ ЭДТА, 0,1% SDS). После полного намокания фильтр утопите. Кристаллизатор
с фильтрами поместите на подвижную платформу. Инкубацию проводите в течение 1-2 ч при 42°С.
3. Предгибридизацию фильтров проводите в гибредизационном растворе при Тг в течение 2-4 ч. Гибридизационный раствор содержит 5xSSPE (или 5xSSC), 5 х Денхардта, 0,1%
SDS и 100-500 мкг/мл озвученной и денатурированной ДНК из спермы лосося.
4. Перенесите фильтры в гибридизационный раствор, содержащий меченный зонд. Перед добавлением в гибридизационный раствор прогрейте зонд при Ю0°С в течение 5-10 мин и
гибиридизация на фильтрах_____________39
охладите во льду.
5. После завершения гибридизации отмойте фильтры от несвя-завшегося зонда в следующем режиме: 30 мин в 4xSSC
0,1% SDS, 30 МИН В 2xSSC, 0,1% SDS, 30 МИН В IxSSC;
0,1% SDS при комнатной температуре в 200 мл в кристаллизаторе на подвижной платформе. I ч в IxSSC и 0,1%
SDS при Тр. При наличии фона - в 0,IxSSC, 0,I%SDS при
Тг.
6. Далее выполняйте предписания пп. 4, 5 предыдущей методики.
Примечание. Если гибридизационный раствор получился мутным, отцентрифугируйте его на К-23 при 5 000 об/мин при комнатной температуре. Следите за тем, чтобы не происходило интенсивного упаривания гибридизационного раствора. Фильтры периодически взбалтывайте, чтобы избежать их слипания. Не допускайте попадания пузырей воздуха между фильтрами.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
I. Метод определения первичной структуры ДНК по Максаму-Гилб ерту
А. Элюция фрагментов ДНК из геля путем диффузии в буфер
Описываемый метод рекомендуется как один из наиболее простых, воспроизводимых и дающих высокий выход. Электро-элюция на диализную мембрану или ДЭАЭ целлюлозу может быть использована также.
1. Кусочек геля, содержащий фрагмент ДНК, вырежьте безопасной бритвой или острым скальпелем, поместите в пробирку "эппевдорф" (1,5 мл) или стеклянную гидрофобиро-ванную пробирку, измельчите стеклянной гидрофобированной палочкой и залейте 5-6 объемами (до образования жидкой суспензии) элюирующего буфера: 150 мМ NaCl, 50 мМ трие-НС1 pH 7,5, 2 мМ ЭДТА. Оставьте суспензию при комнатной температуре на ночь.
Примечание. Буферные растворы, используемые для элюции ДНК следует предварительно прокипятить 15 мин на водяной бане.
2. Суспензию центрифугируйте 1-2 мин и пипеткой отберите супернатант, содержащий ДНК:
3. К кусочкам полиакриламидного геля вновь добавьте элюирующий буфер до исходного объема. Суспензию встряхивайте на миксере 30 мин.
секвестрование ДНК
41
4. Суспензию вновь центрифугируйте, отберите супернатант и объедините его с первым. За выходом фрагмента из геля следите по счетчику радиоактивности, фи необходимости повторите пп. 3, 4.
5. Собранный супернатант освободите от небольших кусочков геля, профильтровав раствор через стекловату, помешенную в носик от автоматической пипетки Р 5000, нанесите на колонку с ДБ-52 (Whataan), приготовленную в желтом носике "эппендорф". Обычно берут 100-200 мкл суспензии, приготовленной на элюирующем буфере. Промойте колонку I мл элюирующего буфера.
6. Фрагмент смойте с колонки 400 мкл буфера: I М NaCi, 50 мМ трис—НС1 pH 7,5, 2 мМ ЭДТА.
7. Добавьте к раствору фрагментаtPHK до концентрации 30 мкг/мл и осадите фрагмент, добавив 2 объема этанола. Выдержите пробирку на -70°С 10 мин, центрифугируйте 5 мин.
8. Полученный осадок растворите в 100 мкл 0,3 М НаАц pH
7,0, добавьте 220 мкл этанола, 10 мин при -70°С. Центрифугируйте 5 мин, осадок промойте (не ресуспенди-руя) в 0,5 мл этанола, подсушите под вакуумом и растворите в 20 мкл бидистиллированной воды.
С ДЕ-52 эффективно элюируются фрагменты до 500 пн, более крупные фрагменты вымываются с потерями. Вместо ДЕ-52 можно использовать элютипы d (S&S). В этом случае и крупные фрагменты смываются без потерь.
![](/pic/spacer.gif)
![](/pic/spacer.gif)
![](./design/pic/spacer.gif)
![](/pic/wildcat.gif)